Untersuchungen zur enzymatischen Enantiomerentrennung von Glykolethern und Etablierung neuer Methoden des synthetischen Shufflings

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen geeigneten Biokatalysator für die Enantiomerentrennung des Modellsubstrats 1-Methoxy-2-Propanol (MP) bzw. seines Esters 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA) bereitzustellen. In den letzten Jahren stieg das Interesse an den enantiomerenreinen Formen dieser Glykolether enorm. In dieser Arbeit richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Evaluierung verschiedener Strategien zur Identifizierung bzw. Optimierung des Biokatalysators. Hierbei sollten sowohl Methoden der de novo Klonierung und der biochemischen Charakterisierung neuer Enzyme, wie auch der gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns bereits bekannter Biokatalysatoren angewandt werden. Das so erhaltene Enzym sollte das Potenzial zum Einsatz in der chemischen Industrie haben, was hohe Anforderungen sowohl an Enantioselektivität wie auch an die Prozessstabilität eines Biokatalysators stellt.

Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Lipase A aus Archaeoglobus fulgidus kloniert und charakterisiert werden. Dieses Enzym, welches sehr geringe Homologie zu anderen bekannten Hydrolasen aufwies, zeigte ein interessantes Profil, speziell in Bezug auf sein pH-Optimum, jedoch keine Hydrolyse von MPA. Es war bekannt, dass die Lipase B aus Candida antarctica (CalB) eine hohe Enantioselektivität vor allem bei der Hydrolyse von MPA zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war daher die Abschätzung der Nutzbarkeit und Verfügbarkeit von CalB für die Enantiomerentrennung von MP / MPA. Die industrielle Anwendung von CalB ist durch die Patentierung dieses Enzyms durch Novozymes beschränkt. Die im zweiten Teil dieser Arbeit etablierte Expression von CalB in Pichia pastoris und die Übertragung des Expressionssystems auf den Fermentationsmaßstab schufen optimale Voraussetzungen für nachfolgende Experimente. Die bei dieser Expression erzielten Ausbeuten übertrafen die anderer Gruppen. Die erzeugten rationalen Mutanten zur Verbesserung der Selektivität in der Umesterung konnten keine Erhöhung der Enantioselektivität bewirken. Die hier erstmals gelungene funktionelle Expression von CalB in E.coli eröffnete jedoch die Möglichkeit zur gerichteten Evolution von CalB und dem Screening auch großer Mutantenbibliotheken, sowohl durch die Methode des Plattenscreenings wie auch durch FACS-Screening.

Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, günstige und schnelle Methode der Gensynthese entwickelt, die zur Darstellung der im vierten Teil der Arbeit verwirklichten Genbank verwendet wurde. Die so gewonnene Lipase 1 aus Moraxella sp. TA144 wurde funktionell in E.coli exprimiert und charakterisiert.

Basierend auf der in dieser Arbeit etablierten Methode der Gensynthese konnte eine Genbank der CalB erstellt werden, die durch eine neue Methode des synthetisches Shuffling dargestellt wurde. Durch mehrere Evaluierungsansätze konnte die Sequenz der Genbank den Anforderungen gemäß optimiert werden, so dass das Auftreten ungewollter Mutationen minimiert werden konnte. In dem folgenden Hochdurchsatzscreening von 19000 Klonen der Genbank im vorher etablierten E.coli Expressionssystem konnte kein Klon mit Lipaseaktivität isoliert werden. Nichtsdestotrotz handelte es sich hierbei um einen interessanten neuen Ansatz der gerichteten Evolution, der nach Optimierung der Lipaseexpression bzw. des Screeningsystems und möglicherweise nach Herabsetzung des Degenerationsgrades zu neuen Biokatalysatoren mit interessanten Eigenschaften führen sollte.

Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass es zur enzymatischen Enantiomerentrennung von MPA im Moment keinen Ersatz zu CalB gibt. Durch die Etablierung der CalB-Expression in E.coli wurde die entscheidende Voraussetzung zur Optimierung der noch verbesserungswürdigen Enantioselektivität, vor allem in der Umesterungsreaktion, sowie der noch geringen Thermostabilität geschaffen. Der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz der gerichteten Evolution zeigte auf, dass bei evolutiven Mutagenesestrategien stets mehrere Variablen existieren, deren Auswirkungen auf das Ergebnis gegeneinander gewichtet werden müssen. So sollte die Variabilität der Mutantenbibliotheken hoch sein, um Klone mit möglichst neuen Kombinationen von gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Gleichzeitig sollte bedacht werden, dass die strukturelle Stabilität der Mutanten mit steigender Variabilität sinkt, so dass der verfügbare Sequenzraum stets begrenzt bleiben muss, um eine zufriedenstellende Ausbeute an funktionellen Klonen zu gewährleisten.

The goal of this work was the production, design, or creation of potential biocatalysts for the resolution of the model substrate 1-methoxy-2-propanol (MP) or its corresponding ester 1-methoxy-2-propanol acetate (MPA), respectively. The work focussed on the evaluation of different strategies for identification and optimization of the biocatalysts. Classical methods of cloning and biochemical characterization of novel enzymes should as well be used as approaches of directed evolution and rational protein design. The enzyme should exhibit the potential to be used in industrial scale, implying a high enantioselectivity as well as high process stability.

The first part of this work covers the heterologous overexpression, purification, and biochemical characterisation of a hydrolase from Archaeoglobus fulgidus. This enzyme, which shows only little sequence homology to any other protein included in the data bases, showed an interesting profile regarding to its pH spectra while MPA was not converted.

The lipase B from Candida antarctica (CalB) was known to exhibit high enantioselectivity in hydrolysis reactions of MPA. Therefore, another aspect of this work was the evaluation of possible applications and the availability of CalB for the resolution of MP / MPA. The established expression of CalB in Pichia pastoris and the subsequent large scale production, which was done in the second part of this thesis, made optimal conditions for mutagenesis experiments in order to optimize the biocatalyst. The yield of CalB expression surpasses the results from other groups. The rational mutagenesis of CalB didn't cause any increase in enantioselectivity. Nevertheless, the functional expression of CalB in E.coli was established which represents a milestone in CalB engineering since it paves the way to the directed evolution of this extraordinary biocatalyst.

In the third part of the thesis a new, convenient and fast technique of gene synthesis was established, which served as method for the synthesis of a gene library as planed in this work. Within one week the whole gene lip1 from the psychrophilic organism Moraxella sp. TA144 with a length of 960 bp was synthesized and cloned. The lipase was functionally expressed and characterized. Based on the mentioned method a gene library of CalB was created, which was synthesized by a novel method of synthetic shuffling. By several approaches of evaluation the sequence of the gene library was optimized according to the demands. The gene library was screened using the established E.coli expression system, whereby no clone with lipase activity was detected. Nevertheless, the system represents an interesting novel approach of directed evolution, which might lead to novel biocatalysts with interesting properties after optimization of the lipase expression, the screening system or the degeneration grade, respectively.

Taken together, this thesis showed that there is in the moment no alternative to CalB in enzymatic resolution of MPA. By the establishment of CalB expression in E.coli the decisive condition for the optimization of the suboptimal enantioselectivity, especially in transesterification, as well as the low process stability, was made. The approach of directed evolution pursued in this thesis therefore demonstrates also the coexistence of several variables the effects of which on the results have to be evaluated. So the variability of a mutant library should be high to obtain clones with new combinations of desired properties. At the same time, the structural stability of the mutants decreases with increasing variability, which requires a limitation of the sequencial room in order to obtain a satisfactory yield of functional clones.