Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes

Abstract

The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.

Die Einführung von Chiralität in C=C Doppelbindungen ist von besonderem Interesse in der organischen Synthese. Insbesondere die katalytische asymmetrische Dihydroxylierung (AD) von Alkenen hat aufgrund der einfachen Umwandlung der chiralen Diol-Produkte in wertvolle Verbindungen beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. In der Chemie liefert die Metall-katalysierte AD von Olefinen sowohl regio- als auch stereospezifisch cis-Diolverbindungen. Neben ihrer Toxizität können diese Metallkatalysatoren durch oxidative Spaltung jedoch auch zur Bildung von Nebenprodukten führen. In der Natur stellen Rieske Nicht-Häm Eisen Oxygenasen (ROs) vielversprechende Biokatalysatoren für diese Reaktion dar, da sie die einzigen bekannten Enzyme sind, die die stereoselektive Bildung von cis-Diolen in nur einem Schritt ermöglichen. ROs sind Schlüsselenzyme beim Abbau von Aromaten und akzeptieren eine große Vielzahl von verschiedenen Verbindungen. Trotz ihres breiten Substratspektrums stehen nur begrenzte Informationen über die Oxidation von nicht natürlichen Substraten mit dieser Enzymklasse zur Verfügung. Um ihr Potential für die Umsetzung von Alkenen zu erforschen, wurden drei ROs für die Oxyfunktionalisierung eines Sets an strukturell unterschiedlichen Olefinen getestet, das sowohl lineare und zyklische Aryl-substituierte Alkene, Cycloalkene als auch verschiedene Terpene umfasste. Naphthalen- (NDO), Benzen- (BDO) und Cumoldioxygenasen (CDO) aus verschiedenen Pseudomonas Stämmen wurden ausgewählt, da sie zu den RO Enzymen gehören, mit denen bereits die Oxidation einiger weniger Olefine gezeigt werden konnte. Die Mehrheit der getesteten Verbindungen aus dem Substratpanel konnte von NDO, BDO oder CDO umgesetzt werden und die gebildeten Produkte wurden entweder isoliert und mittels NMR Spektroskopie charakterisiert oder anhand eines Standards identifiziert. Abhängig vom Substrat wurde neben den entsprechenden Diol-Produkten auch die allylische Monohydroxylierung beobachtet, eine Reaktion, die chemisch immer noch am verlässlichsten mit stöchiometrischen Mengen an SeO2 durchgeführt wird. Da die Wildtyp ROs von Natur aus die Dihydroxylierung aromatischer Verbindungen katalysieren, zeigten sie jedoch nur geringe Umsätze (< 50%) und moderaten Stereoselektivitäten (≤ 80% ee/de) für mehrere der untersuchten Alkene. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Veränderungen in der Struktur des aktiven Zentrums der ROs eingeführt. Eine einzelne gerichtete Punktmutation, die anhand von Sequenz- und Strukturvergleichen mit anderen Mitgliedern der RO Familie identifiziert wurde, reichte aus, um CDO und BDO Varianten mit erheblichen Veränderungen in der Regio- und Stereoselektivität für verschiedene Substrate zu generieren. Insbesondere in Biotransformationen mit der CDO Mutante M232A konnten exzellente Stereoselektivitäten (≥ 95% ee/de) und gute Aktivitäten (> 90%) auch für lineare Alkene erzielt werden, die als schwierige Substrate für die RO-katalysierte Oxyfunktionalisierung beschrieben worden sind. Ortsgerichtete Sättigungsmutagenese an Position 232 in CDO zeigte einen Zusammenhang zwischen dem räumlichen Anspruch der Aminosäureseitenkette und ihrem Einfluss auf die Regio- und/ oder Stereoselektivität für zwei Substrate, Styrol und Inden. Während das Wildtyp Enzym fast ausschließlich die Dihydroxylierung des aromatischen Rings katalysierte, wurde die Regioselektivität mit abnehmender Größe der Seitenkette zur terminalen Vinylgruppe von Styrol verschoben und bis zu 96% des Alken-1,2-diols gebildet. Für die Bildung von cis-1,2-Indandiol konnten enantiokomplementäre Enzyme generiert werden, was die Bedeutung von Position 232 für das Engineering von ROs weiter verdeutlicht. Darüber hinaus wurden durch ortsgerichtete Sättigungsmutagenese von zusätzlichen Aminosäuren in der Substratbindetasche von CDO (F278, I288, I336 und F378) weitere Positionen identifiziert, die einen Einfluss auf die Selektivität und Produktbildung bei der Oxidation von Alkenen haben. Um die Anwendbarkeit von ROs in der organischen Synthese zu zeigen, wurden Biotransformationen in einem semi-präperativen Maßstab (70 mg) mit ausgewählten Substraten und CDO M232A als Biokatalysator durchgeführt. Ohne weitere Optimierung des Reaktions-Setups konnten die entsprechenden Produkte mit > 30% Ausbeute erfolgreich isoliert werden. Zusätzlich wurde die Hydroxylierung von (R)-Limonen mit wachsenden Zellen in einem Bioreaktor auf 4 L hochskaliert, wobei die isolierte Produktausbeute von 0.4 g L-1 durch die Flüchtigkeit des Substrats sowie die Produkttoxizität verringert wurde. Schlussfolgernd zeigen diese Beispiele, dass eine einzelne Punktmutation ausreichend ist, um CDO Wildtyp in einen effizienten Biokatalysator zu verwandeln und stellen des Weiteren das erste Beispiel für das rationale Engineering von CDO und BDO Enzymen für die Oxyfunktionalisierung eines breiten Spektrums an Alkenen dar.