Herausforderungen in der Herstellung, Reinigung und Charakterisierung der humanen α-Defensine 5 und 6

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die beiden humanen α-Defensine 5 und 6 und die Möglichkeiten zu Ihrer rekombinanten Herstellung in großen Mengen untersucht. Die Herstellung der Defensine erfolgte in den gängigen Expressionssystem E. coli und P. pastoris. Der Gesamtprozess zeigte sich als herausforderungsvoll sowie zeit- und kostenintensiv, so dass die Etablierung robuster Herstellungsprozesse nicht uneingeschränkt realisierbar war. Das mature HD5 (mHD5) konnte erstmals in E. coli in Form eines rekombinanten mHD5-Tetramers in hohen Ausbeuten exprimiert werden. Die Aufarbeitung dieses Tetramers unter Gewinnung des Monomers gestaltete sich bisher als schwierig und bedarf weiterer Optimierungsarbeiten. Die Herstellung desselben Defensins in P. pastoris dagegen lieferte nach Aufreinigung bioaktives rmHD5 in Ausbeuten bis zu 290 mg/L, dessen Produktverteilung neben korrekt prozessierten rmHD5 auch fehlprozessierte rmHD5-Formen mit zusätzlichen Aminosäuren am N-Terminus des Peptids aufwies. Das Produktgemisch, bestehend aus rmHD5 und verlängerten rmHD5-Peptiden, zeigte sich in antimikrobiellen Tests gegen Staphylococcus carnosus und Micrococcus luteus als vergleichbar aktiv mit dem synthetischen HD5. Das mature HD6 (mHD6) konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals erfolgreich mit einer Ausbeute von 51 mg/L in das Medium von Pichia pastoris sekretiert werden. Nach Aufreinigung konnte mHD6 mit einer Ausbeute 27 mg/L erfolgreich gewonnen werden.