Biokatalyse mit Cytochrom P450 Monooxygenasen: zur selektiven Oxidation von Terpenen und Fettsäuren

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die selektive Oxyfunktionalisierung von alpha-Pinen sowie von hoch verzweigten Fettsäuren und Fettsäurederivaten zur Herstellung wertvoller Produkte und Synthesebausteine für die Riechstoff- und Pharmaindustrie. Die dabei verwendeten Biokatalysatoren CYP102A1 (P450 BM-3) aus Bacillus megaterium bzw. CYP102A2 und CYP102A3 aus Bacillus subtilis gehören zur Klasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen. Diese sind in der Lage, molekularen Sauerstoff unter Aufnahme zweier Elektronen zu aktivieren und ein Sauerstoffatom auf das Substratmolekül zu übertragen, wobei das andere Sauerstoffatom in Form von Wasser freigesetzt wird. Die hier untersuchten Enzyme der CYP102A-Familie nehmen aufgrund ihrer Domänenarchitektur eine Sonderstellung unter den Monooxygenasen ein. Es handelt sich bei ihnen um Fusionsproteine, die eine FAD/FMN-enthaltenden Reduktasedomäne und eine Monooxygenasedomäne in einer Polypeptidkette enthalten, was einen effizienten Elektronentransfer gewährleistet und somit für die höchsten mit P450 Monooxygenasen gemessenen Umsatzraten sorgt (>1500 min-1 gegen unverzweigte Fettsäuren). Darüber hinaus sind sie nicht membrangebunden und somit wasserlöslich sowie stabil, was sie zu interessanten Kandidaten für die Etablierung biotechnologischer Prozesse macht. Hoch verzweigte Fettsäuren und Fettsäurederivate konnten mit Hilfe von CYP102A1 und der Dreifachmutante CYP102A1 A74G F87V L188Q regioselektiv hydroxyliert und somit zu Synthesebausteinen für die Produktion von Makrolidantibiotika umgesetzt werden, die dabei erzielten Umsatzraten erreichen die für unverzweigte Fettsäuren gemessenen Größenordnungen. Durch Aufnahme von Substratbindungsspektren konnte geklärt werden, dass – entgegen der Erwartung – hoch verzweigte Substrate das aktive Zentrum von CYP102A2 und A3 nicht erreichen. Die oben beschriebene Dreifachmutante war in der Lage, (-)-alpha-Pinen mit hoher Regioselektivität in Pinenepoxid umzuwandeln (72%, CYP102A1 A74G F87V L188Q), darüber hinaus ist es durch Anwendung von rationalem und datenbasiertem Proteindesign gelungen Mutanten herzustellen, die (-)-alpha-Pinen ebenfalls mit hoher Selektivität zu Verbenol umsetzen. Bei der Entwicklung der Mutanten kamen Methoden wie Einfachsättigungsmutagenese oder ortsgerichtete Mutagenese zum Einsatz, wobei auch im Rahmen einer Kooperation durchgeführte molekulardynamische Simulationen zur Verbesserung der Regioselektivität von CYP102A1-Mutanten bei der Oxidation von (-)-alpha-Pinen beigetragen haben. Um die durch Mehrfachsättigungsmutagenese erzeugten Mutanten im Hochdurchsatzverfahren durchmustern zu können, wurden die dafür notwendigen Arbeitsschritte optimiert und weitgehend automatisiert. Zudem konnte ein produktspezifischer, hochdurchsatzfähiger Test entwickelt werden, der auf einer Farbreaktion zwischen Verbenol und schwefelsaurer Vanillinlösung beruht und die quantitative Bestimmung von Verbenolkonzentrationen >1 mM in Mikrotiterplatten erlaubt. Nach Durchmusterung einer 5000 Klone umfassenden Mutantenbibliothek konnte schließlich die hochselektive CYP102A1 Y51V A74G F87V A111T L188S Fünffachmutante isoliert werden, die (-)-alpha-Pinen mit einer Umsatzrate von 218 min-1 zu 88% Verbenol hydroxyliert, was eine weitere Verbesserung der Aktivität der zuvor identifizierten CYP102A1 A74G F87A L188Q (83 min-1) Dreifachmutante bedeutete. Eine weitere Charakterisierung der (-)-alpha-Pinen oxidierenden Mutanten erfolgte in 10 ml Ansätzen unter Verwendung eines auf Formiatdehydrogenase basierendem Kofaktorregenerierungssystems, was den quantitativen Einsatz des teuren Kofaktors NADPH überflüssig machte. Außerdem sorgte die Verwendung einer organischen Phase für eine in situ Produktabtrennung, was die Stabilität der gebildeten Produkte unter Prozessbedingungen erhöhte. Die hier im 10 ml Maßstab erzielten Raum-Zeit-Ausbeuten (bis zu 450 mg l-1 h-1) übertreffen die bisher bekannten Verfahren zur mikrobiellen bzw. enzymkatalysierten Oxidation von alpha-Pinen um Größenordnungen.

P450 monooxygenases are highly versatile biocatalysts which are able to carry out a vast variety of oxidation reactions including epoxidation and hydroxylation of aliphatic and aromatic hydrocarbons. Their ability to introduce oxygen into non-activated C-H-bonds is one of the potentially most useful catalytic reactions. Nevertheless, P450-catalysed reactions play only a minor role in today's industrial biocatalysis. The complexity of the monooxygenase system causes high costs in a biotechnological process. Therefore the use of P450-driven reactions is only worth being considered if cheap starting materials can be converted to valuable products with high activity and selectivity. Such reactions were the issue particularly addressed in this thesis. Highly branched fatty acids and derivatives isolated from the preen gland waxes of ducks and geese are interesting natural substances, as they contain several chiral centres with defined stereochemistry making them interesting candidates for use as building blocks in chemical synthesis. One possible application is the production of macrolide antibiotics like borrelidin, which are difficult to access via classical synthetic routes. An essential step in a biocatalytic synthetic approach is the highly selective hydroxylation of the branched building blocks to allow the formation of the macrocyclic lactone. Wildtypes of CYP102A1, A2 and A3 as well as the CYP102A1 A74G F87V L188Q triple mutant have been screened for activity towards 16 different branched fatty acids and fatty acid derivatives. It turned out, that the A1 wildtype was able to hydroxylate most substrates with high regioselectivity but poor activity. The wildtypes of CYP102A2 and A3 were not suitable for hydroxylation of the branched substrates. In contrast, the triple mutant showed outstanding activity towards most of the investigated substrates with initial turnover frequencies up to 1200 min-1. The hydroxylation took place with complete regioselectivity for the majority of substrates, increasing the chance for the development of an efficient biocatalytic process. Another substrate of interest was alpha-pinene, a waste product from pulp processing, whose oxidised products are valuable compounds for the flavour-, fragrance- and pharma industry. The primary products of P450-catalysed oxidation of alpha-pinene are verbenol, which could be used e.g. as an environmentally friendly insecticide and pinene oxide, which provides access to various compounds with characteristic sensory attributes.

Several approaches of protein design have been used to develop mutants of CYP102A1 that are able to oxidise alpha-pinene selectively, including site directed mutagenesis and site saturation mutagenesis. In summary, one mutant - CYP102A1 A74G F87V L188Q - could be identified which is able to convert alpha-pinene to pinene oxide with high regioselecitvity (72%) and activity (249 min-1). In contrast, another mutant CYP102A1 A74G F87A L188Q showed a high preference for the production of verbenol (89%) with an activity of 83 min-1. Screening of a mutant library with 5000 clones created by multi site saturation mutagenesis resulted in the identification of a CYP102A1 Y51V A74G F87A A111T L188S mutant which showed high selectivity for the production of verbenol (89%) and an increased initial activity of 218 min-1. The regioselecitvities revealed by the engineered P450 monooxygenases are the highest reported for the biocatalytic oxidation of alpha-pinene so far. The most selective and active mutants of CYP102A1 for the oxidation of alpha-pinene were characterised and used in a 10 ml scale process under cofactor regeneration with a formate dehydrogenase (FDH) from Pseudomonas sp. 101. The FDH oxidises formate with concomitant reduction of NADP+ to NADPH, superseding the supply of stoichiometric amounts of expensive NADPH. To prevent the degradation of the alpha-pinene oxidation products, a biphasic system with alpha-pinene as second organic phase was used, protecting the product from degradation and allowing the in situ product extraction. As an additional relevant reaction parameter, the influence of oxygen concentration was investigated. Oxygen is a cosubstrate of P450-catalysed reactions, but its solubility in aqueous media is poor (0,3 mM), so all reactions were carried out in air and in a 100% oxygen atmosphere to reveal differences in activity. Three mutants were characterised using the described reaction setup: CYP102A1 A74G F87V L188Q, CYP102A1 A74G F87A L188Q and CYP102A1 Y51V A74G F87A A111T L188S.