Investigation of proteins responsible for the establishment and recognition of prominent lysine modifications

Abstract

Histone post-translational modifications influence chromatin architecture, either by direct effects on the interaction between histones and DNA, or indirectly, by serving as docking places for regulatory proteins, which bind through conserved functional domains termed “reading” domains. Different combinations of histone modifications define various chromatin states, each of which being associated with a particular set of regulatory enzymes. Lysine methylation is an important histone post-translational modification, which can occur at various positions in histones, with different roles in epigenetic regulation. This mark is generally established by SET domain Protein Lysine Methyltransferases (PKMTs). Recently, PKMTs have been reported to also methylate numerous non-histone substrates, which subsequently recruit so called “reading” domains. These domains specifically interact with the methylated lysine in a sequence context-dependent manner. In this work, I tried to establish a Yeast-3-Hybrid method for the identification of methylation-dependent interactors of methylated non-histone proteins. For validation, I attempted to test the interaction between reported PKMT substrates fused to the Gal4-DNA-Binding Domain and methyl-“readers” fused to the Gal4-Activation Domain in yeast, either in the presence or absence of the corresponding PKMTs. Later in the project the known “reading” domains would be replaced by a library of human cDNA, in order to search for novel “readers” of protein lysine methylation marks. Additionally, this work presents the study of the substrate specificities of two SET domain methyltransferases responsible for the methylation of histone 3 lysine 4 (H3K4), which are mutually exclusive members of the same coactivator complex, the human COMPASS. In this study, SET1A, an H3K4 trimethylase, was shown to be active only as part of the core COMPASS complex. This PKMT proved to have a higher preference for some sequences other than histone 3, justifying a search for novel non-histone substrates. MLL2, a member of the mixed lineage leukemia (MLL) family, responsible for H3K4 monomethylation, revealed stimulation of activity when part of the core COMPASS complex, and showed some differences in the substrate specificity when acting alone, compared to the complex. The search for non-histone protein substrates is in progress for SET1A/COMPASS, and also MLL2 alone and within the complex. The targeting of most PKMTs is achieved with the help of histone modification “reading” or DNA-binding domains. The binding specificity of the PHD finger “reading” domains of MLL2, and its paralog MLL3, was investigated during this doctoral study. Although most of the PHD fingers did not bind to histone tails, the MLL2 PHD 3-5 group of domains and the MLL3 PHD 4-6 group of domains bound specifically to modified histone tail peptides. Preference towards both histone 3 (H3) and histone 4 (H4) was identified and the strongest binding was seen on H4 peptides containing acetylation at lysine 16 together with multiple acetylations or methylations. This finding suggested recruitment to active chromatin, which is enriched in acetylation marks, but the specificity needs to be further confirmed and characterized in more detail. I also investigated the histone binding specificity of PHF1, a member of the Polycomb Repressive Complex 2. This complex is responsible for developmental gene repression by the trimethylation of histone 3 lysine 27 (H3K27me3). The tudor domain of PHF1 showed preferred binding to its target, H3K27me3 in the sequence context of testis-identified histone variant H3T, in comparison to the canonical histone H3.1. The specificity for the same mark and histone variant was also identified for the chromodomain of the Polycomb Repressive Complex 1 member, CBX7, while the chromodomain of its paralog, CBX2, did not show discrimination between the histone variants, although it presented the same specificity towards the H3K27me3 mark. We propose that the discrimination between histone variants is a unique feature of some “reading” domains, and the role of this particular function needs to be elucidated. Moreover, the H3K27me3-specific CBX7 chromodomain was used as a tool in the validation of new methods developed by Kungulovski et al., 2014, with the purpose of replacing antibodies raised against specific histone modifications in adaptations of several antibody-based assays. Finally, this PhD work also presents the binding specificity of the chromodomain of the SUV39H1 methyltransferase. SUV39H1 is responsible for histone 3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3), and the consequent gene repression and silencing of heterochromatin. I showed that the chromodomain of SUV39H1 bound specifically to H3K9me3, and binding of the chromodomain to its target peptide seemed to inhibit the catalytic activity of the enzyme in our in vitro conditions.

Posttranslationale Modifikationen an Histonen beeinflussen die Chromatin Struktur. Dies erfolgt entweder direkt durch die Interaktion zwischen Histonen und DNA, oder indirekt, durch Bindung von regulatorischen Proteinen. Die Bindung dieser Proteine erfolgt durch konservierte funktionelle Domänen, genannt „reading“ Domänen. Verschiedene Kombinationen von Histonmodifikationen definieren eine Vielzahl von verschiedenen Chromatinzuständen, von denen jeder Zustand mit einem bestimmten Repertoire an regulatorischen Enzymen assoziiert ist. Lysin-Methylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation von Histonen. Diese kann an verschiedene Stellen mit unterschiedlichen Funktionen in der epigenetischen Regulation auftreten. Diese Markierung wird generell durch Protein Lysin Methyltransferasen (PKMTs) mit einer SET Domäne eingeführt. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass PKMTs auch zahlreiche Nicht-Histon Substrate methylieren können, welche anschließend mit sogenannten „Lesedomänen“ spezifisch interagieren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, eine Yeast-3-Hybrid Methode zu entwickeln, um damit methylierungsabhängige Interaktionspartner von Lysin methylierten Proteinen zu identifizieren. Zur Validierung dieser Methode wurde in Hefe die Wechselwirkung zwischen bekannten PKMT Substraten, welche an die Gal4-DNA-Bindungsdomäne fusioniert waren, und Methyl-„Lesedomänen“, welche an die Gal4-Aktivierungsdomäne fusioniert waren, werden in An- und Abwesenheit der PKMT untersucht. Später in diesen Project sollen die bekannten “Lesedomänen” durch eine Sammlung von humanen cDNAs ersetzt werden, um anschließend nach neuen “Lesedomänen” für Lysin methylierte Proteinen zu suchen. Zusätzlich, wurde in diese Arbeit die Substratspezifität zweier Methyltransferasen untersucht, die eine SET Domäne enthalten und Histon 3 Lysin 4 (H3K4) methylieren. Beide Methyltransferasen binden unabhängig voneinander an denselben Koaktivator Komplex, welcher COMPASS genannt wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass SET1A, eine H3K4 trimethyl-Transferase, nur im COMPASS Komplex aktiv ist. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass diese PKMT einige Sequenzen bevorzugt methyliert, welche nicht in Histon 3 vorkommen, was eine Suche nach neuen Nicht-Histon Substraten nahelegt. MLL2, ein Mitglied der „mixed lineage leukemia“ (MLL) Familie, ist verantwortlich für H3K4 mono-Methylierung. Es wurden unterschiedliche Substratspezifitäten beobachtet, wenn MLL2 alleine oder als Teil des „COMPASS“ Komplexes eingesetzt wurde. Die Identifikation von Nicht- Histon Substraten ist sowohl für SET1A als auch MLL2 allein und innerhalb des Komplex in Arbeit. Das Targeting der meisten PKMTs wird mit Hilfe von Histon „Lesedomänen“ oder DNA-Bindungsdomänen ermöglicht. In dieser Arbeit wurde die Bindungsspezifität der PHD Finger „reading“ Domänen von MLL2 und seinem Paralog MLL3 untersucht. Obwohl die meisten PHD Finger nicht mit dem N-terminalen Ende der Histone interagieren, konnte dennoch gezeigt werden, dass die Domänen MLL2 PHD Gruppe 3-5 und MLL3 PHD 4-6 spezifisch an das modifizierten N-terminale Ende von Histonpeptiden binden. Eine Bindungspräferenz konnte sowohl für Histone 3 (H3) und Histone 4 (H4) identifiziert werden. Die stärkste Bindung konnte für das H4 Peptid gezeigt werden, welches am Lysin 16 eine Acetylierung zusammen mit weiteren Acetylierungen oder Methylierungen aufweist. Der allgemeine Trend zeigt eine Rekrutierung an aktives Chromatin, in welchem hauptsächlich Acetylierungsmarkierungen vorhanden sind. Die Spezifität sollte jedoch weiter untersucht und detaillierter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurde außerdem die Histon Bindungsspezifität von PHF1, einem Mitglied des „Polycom Repressiv Complex 2“, charakterisiert. Durch diesen Komplex erfolgt die tri-Methylierung von Lysin 27 an Histon 3 (H3K27me3), welche zu einer Genrepression führt. Die Tudor Domäne von PHF1 zeigt unterschiedliche Bindungsspezifitäten für H3K27me3, und bevorzugt die in Testis identifizierte Variante H3T im Vergleich zur kanonische Variante H3.1. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Chromodomäne von CBX7, einem Mitglied des Polycomb Repressive Complex 1, erzielt. Das Paralog CBX2 weist allerdings keine Unterschiede in der H3K27me3 Bindung zwischen den Histon Varianten auf. Daraus kann gefolgert werden, dass die Unterschiede zwischen den Histon Varianten eine besondere Eigenschaft einiger „Lesedomänen“ darstellt und diese besondere Eigenschaft weitere Untersuchungen erfordert. Außerdem wurde die Chromodomäne von CBX7,welche spezifisch für H3K27me3 ist, als ein Werkzeug für die Validation einer neuen Methode verwendet. Diese Methode,entwickelt von Kungulovski et al., (2014), hat das Ziel, Antikörper zu ersetzen, welche gegen spezifische Histon Modifikationen eingesetzt werden. Schließlich wurde die Bindungsspezifität der Chromodomäne der SUV39H1 Methyltransferase untersucht. SUV39H1 ist verantwortlich für die Histon 3 tri-Methylierung am Lysin 9 (H3K9me3), woraus eine Genrepression und Stilllegung von Heterochromatin resultiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Chromodomäne von SUV39H1 spezifisch mit H3K9me3 interagiert und dass die Bindung der Chromodomäne zu seinem Targetpeptid zu einer Inhibiton der katalytischen Aktivität des Enzyms unter den verwendeten in vitro Bedingungen führt.