Systembiologische Untersuchungen zur Optimierung mikrobieller Produzenten schwefelhaltiger Aminosäuren

Abstract

Die schwefelhaltige und essentielle Aminosäure L-Methionin besitzt vor allem aufgrund ihres Einsatzes zur Supplementierung von pflanzlichem Tierfutter eine enorme wirtschaftliche Bedeutung. Der globale Jahresbedarf wird auf ca. 1.000.000 Tonnen geschätzt und weist angesichts eines ansteigenden Fleischbedarfs, insbesondere in Schwellenländern, stabile jährliche Wachstumsraten von ca. 5-6% auf. Methionin wird derzeit nahezu ausschließlich durch chemische Synthese (Evonik-Verfahren) als DL­-Razemat hergestellt. Ein moderner biotechnologischer Prozess würde eine nachhaltige Alternative zu bisher petrochemisch-basierten Verfahren darstellen und bietet das Potential einer erheblichen Kostensenkung, höherer Substratflexibilität sowie der Herstellung von enantiomer-reinem L-Methionin. Eine Überproduktion von L-Methionin stellt allerdings aufgrund der Komplexität zugrundeliegender Stoffwechselwege, einer strikten zellulären Regulation und eines vergleichsweise hohen energetischen Syntheseaufwands innerhalb gängiger mikrobieller Plattformen eine große Herausforderung dar. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels systembiologischer Ansätze ein durch die Evonik Industries AG bereitgestellter Modellproduzent (E. coli SPOT01) auf Potentiale zu einer gezielten Methionin-Überproduktion untersucht. Rationale Stammoptimierungen basieren auf systematische genetische Modifikationen und setzen ein dynamisch-quantitatives Verständnis zugrundeliegender intrazellulärer Stoffwechselnetzwerke voraus (Systems Metabolic Engineering). Innerhalb zielgerichteter metabolischer Perturbationsanalysen können Kontrolleinflüsse beteiligter Enzyme auf die zu optimierenden Zielflüsse auf systemischer Ebene quantifiziert werden (Metabolic Control Analysis). Derartige Ansätze erfordern eine abgestimmte Anwendung intrazellulärer Metabolomanalysen, adäquater Perturbations- und Probennahmestrategien sowie mathematischer Modellierung. Hierzu wurde eine universelle LC-ESI-MS/MS-Methode entwickelt, die eine sensitive und selektive Quantifizierung eines breiten Spektrums niedermolekularer Metabolite des zellulären Stoffwechsels ermöglicht (Metabolic Profiling). In umfangreichen Transportkinetik-Studien konnte anschließend mit L-Serin ein alternatives und netzwerk-inhärentes Stimulussubstrat identifiziert werden, das eine direkte und zielgerichtete Perturbation des L-Methionin-Synthesenetzwerks ermöglicht. Unter Anwendung adaptierter Stimulusszenarien sowie semi-automatisierter Beprobungsstrategien konnten innerhalb produktionsrelevanter Kultivierungsbedingungen von E. coli SPOT01 aussagekräftige Konzentrationsdynamiken fokussierter Metabolitpools erzielt werden. Für die quantitative Auswertung resultierender Perturbationsprofile wurde ein modellbasierter Ansatz unter Verwendung einer nicht-mechanistischen LinLog-Kinetik sowie ein rein datengetriebener Ansatz unter Verwendung des PEC-Kriteriums (Pool Efflux Capacity) verfolgt. Insbesondere die PEC-Analyse stellte sich hierbei als zielführender Ansatz heraus, der aufgrund seiner hohen Robustheit auch bei messtechnischen Unsicherheiten valide Aussagen im Rahmen der Kontrollanalyse erlaubt. Innerhalb unterschiedlicher Perturbationsstudien konnten hierbei übereinstimmend die Cystathionin-β-Lyase (MetC), die Methioninsynthase (MetH/E) und das Methionin-Exportsystem (YjeH) als Enzyme mit hoher Flusskontrolle identifiziert werden. Aufgrund einer ausgeprägten Akkumulation des Vorläufermetabolits L-Homocystein und eines zunehmenden Übergewichts gegenüber L-Cystein, erfolgt die unspezifische Umsetzung des cytotoxischen Intermediats zum Akkumulationsprodukt Homolanthionin. Der unspezifische Abbau von Homolanthionin führt zur erneuten Bildung von L-Homocystein und stellt den Ausgangspunkt für eine alternative Syntheseroute des Haupt-Nebenprodukts L-Isoleucin. Dieses für die L-Methioninsynthese höchst unvorteilhafte Akkumulationsszenario (Kohlenstoff- und Energieverlust) konnte letztlich auf ein Ungleichgewicht in der Bereitstellung von L-Aspartat (TCA-Syntheseweg) und L-Serin (EMP-Syntheseweg) zurückgeführt werden. Unter Einsatz des vollmarkierten Stimulussubstrats [U13C]-L-Serin konnte der Informationsgehalt resultierender instationärer Datensätze weiter gesteigert werden. Die hohe Flusskontrolle durch die Methioninsynthase (MetH/E) konnte hierbei eindeutig auf eine limitierte Transmethylierungskapazität durch den C1-Stoffwechsel zurückgeführt werden. Ein Schlüsselenzym in diesem Zusammenhang stellt die Hydroxymethyltransferase (GlyA) dar, welche unter Umsetzung von L-Serin Methylgruppen für die finale Transmethylierung bereitstellt. Durch eine gezielte Erhöhung der enzymatischen Affinität von GlyA zu seinem Substrat L-Serin kann eine Kompensation des TCA/EMP-Ungleichgewicht unter einer gleichzeitigen Aufhebung des Akkumulationszyklus erfolgen.

The sulfurous and essential amino acid L-methionine is of enormous industrial importance, mainly due to its addition to plant-based animal feed products. The annual global demand is estimated at about 1,000,000 tons and the annual growth rates are stable at 5-6%, caused by an increasing need for meat, particularly in developing countries. Currently, methionine is produced exclusively by chemical synthesis as DL-racemate (Evonik procedure). Modern biotechnological processes represent a sustainable alternative to the hitherto existing petrochemical based syntheses and offer the potential of significant cost reduction, higher substrate flexibility and production of enantiopure L-methionine. However, an overproduction of L-methionine in common microbial producers is challenging due to the complexity of underlying metabolic pathways, a strict cellular regulation and comparably high energetic efforts for the synthesis. In the present study a promising L-methionine producer provided by the Evonik Industries AG (E. coli SPOT01) was investigated by systems biology tools triggering product synthesis. Rational strain developments are based on targeted genetic modifications and require an extensive quantitative understanding of corresponding intracellular metabolic networks (Systems Metabolic Engineering). In this context, metabolic pulse experiments enable the quantification of control properties of involved enzymes on intracellular target fluxes at a systemic level (Metabolic Control Analysis). Such experimental concepts require a concerted application of intracellular metabolome analysis, appropriate pulse and sampling strategies, as well as mathematical modeling. For this purpose, a comprehensive LC-ESI-MS/MS method has been developed for a quantitative analysis of a broad range of common metabolites of the cellular metabolism with high selectivity and sensitivity (Metabolic Profiling). Through extensive transport kinetic studies, L-serine has subsequently been identified as an alternative and network-inherent stimulus substrate, allowing a direct and targeted perturbation of the L-methionine synthesis network. Adapted stimulus scenarios and rapid semi-automatized sampling strategies were applied to monitor metabolic dynamics as a function of external stimuli in connection to production-related cultivation conditions of E. coli SPOT01. Transient metabolic data were analyzed quantitatively by a non-mechanistic linlog kinetic model and purely data-driven approach using the PEC criterion (Pool Efflux Capacity). Especially the PEC analysis emerges as a straight-forward approach, which enables valid results even in case of metrological uncertainties due to its inherent robustness. As the result of various perturbation studies, the cystathionine-β-lyase (MetC), the methionine synthase (MetH/E) and the methionine exporter system (YjeH) were identified concurringly as enzymes with high flux control. In this regard, a distinct accumulation of the precursor L-homocysteine and an increasing overweight towards to L-cysteine, results in an unspecific metabolization of the cytotoxic intermediate to the accumulation product homolanthionine. The unspecific degradation of homolanthionine leads to a renewed formation of L-homocysteine and represents the entry point for an alternative synthesis route of the main byproduct L-isoleucine. This highly unfavorable accumulation scenario concerning the methionine synthesis (loss of carbon and energy) is ultimately based on an imbalance in the supply of L-aspartate (TCA synthesis route) and L-serine (EMP synthesis route). In order to enhance the information content of resulting transient metabolic data, the experimental design was additional adapted by utilization of full labeled [U13C]-L-serine as stimulus substrate. The high flux control by the methionine synthase (MetH/E) is certain to being attributed to a limited transmethylation capacity by the C1 metabolism. In this connection the hydroxymethyltransferase (GlyA) represents a key enzyme which provides the final transmethylation of L-homocysteine with methyl groups by degradation of L-serine. A targeted enhancement of the enzymatic affinity of GlyA to its substrate L-serine could lead to a compensation of the TCA/EMP imbalance and a simultaneous elimination of the accumulation cycle.