Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren gegenüber unterschiedlichen p53 Aktivatoren

Abstract

Die tumorsuppressiven Eigenschaften von p53 gelten als zentral bei der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Auf Grund dessen spielt p53 eine Schlüsselrolle bei der Reaktion auf genomischen Stress welcher unter anderem durch klassische Chemotherapeutika, wie beispielsweise Cisplatin, induziert wird. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle des p53-Status für die Sensitivität gegenüber p53-aktivierenden Substanzen untersucht. Hierfür wurde eine Auswahl von Zelllinien aus verschiedenen Entitäten und mit unterschiedlichen p53-Genotypen sowie Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von gesunden Donoren verwendet. Als p53-Aktivatoren wurden neben dem klassischen DNA-modifizierenden Molekül Cisplatin die direkten Aktivatoren von p53, Nutlin-3 und RITA eingesetzt. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen zu einem G1-Arrest. Dieser trat auch in primären, nichtmalignen Zellen auf. Nutlin-3 agiert somit selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen, nicht aber tumorselektiv. Die wtp53-selektive Wirkungsweise konnte weder nach Cisplatin- noch nach RITA-Behandlung nachgewiesen werden. Beide Substanzen induzierten Zelltod auch in mtp53-Systemen oder im Falle von RITA auch in der p53-null-Zelllinie OVCAR5. Der durch Cisplatin und RITA induzierte Zelltod in der wtp53-exprimierenden Zelllinie NTERA-2D1 konnte auf die Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. Hingegen war der in den mtp53-exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 induzierte Zelltod im Falle einer Behandlung mit Cisplatin oder RITA unabhängig von mtp53. Zudem führte die siRNA-vermittelte Depletion von p63 und p73 zu keiner Verminderung des Zelltods. Cisplatin und RITA können somit unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod in p53-defekten Systemen induzieren. Dieser war für beide Substanzen auf die Aktivierung der mitochondrialen Effektoren BAX und BAK zurückzuführen. Die Induktion von Zelltod nach Cisplatin-Behandlung konnte weiterhin auf die Aktivierung der pro-apoptotischen Bcl-2-Proteine NOXA und PUMA zurückgeführt werden. Die Analyse der konstitutiven Expression der Bcl-2-Proteine in der gesamten Zelllinienauswahl zeigte eine signifikante Korrelation des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gegenüber der Cisplatin-Sensitivität. NOXA und Bcl-w wurden in diesem Ansatz als prädiktive Marker der Cisplatin-Sensitivität innerhalb der Zellauswahl identifiziert. Die Kombinationsbehandlung von Cisplatin mit dem BH3-mimetic ABT-737 führte zu einer Sensitivierung von Cisplatin-insensitiven Zellen. Im Falle der Behandlung mit RITA konnte keine Korrelation zwischen dem Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen und dem durch RITA induzierten Zelltod festgestellt werden. Jedoch erwies sich die Herunterregulation von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen nach RITA-Behandlung als wichtig für die Induktion von Apoptose. Infolgedessen führte die Kombinationsbehandlung von RITA mit ABT-737 zu einer Verstärkung des RITA-induzierten Zelltods in RITA-sensitiven Zellen. RITA-insensitive Zellen blieben dabei unbeeinflusst. Weiterhin konnte der durch RITA vermittelte Zelltod in p53-defekten Systemen auf die Aktivierung des JNK- und p38-Signaltransduktionsweges zurückgeführt werden. Insbesondere JNK1 erwies sich als entscheidend für die Induktion von Apoptose nach RITA-Behandlung. Im Vergleich der drei Substanzen zeigte sich überraschenderweise eine größere Ähnlichkeit von RITA zu Cisplatin als zu Nutlin-3. Cisplatin, als klassischer über DNA-Schädigung wirkender p53-Aktivator, führte zur Induktion von Zelltod in Zelllinien welche nahezu alle auch sensitiv gegenüber der Behandlung mit RITA waren. Potentiell könnte somit auch RITA über DNA-Schädigungen Zelltod induzieren. Intrazellulär führen jedoch beide Substanzen zu unterschiedlichen Effekten. Während Cisplatin zu einer Hochregulation von pro-apoptotischen BH3-only-Proteinen führt, induziert die Behandlung mit RITA eine Reduktion anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine. Im Falle von Cisplatin konnte die Proteinkonzentration von NOXA und Bcl-w als Marker für die Sensitivität innerhalb der Zellauswahl identifiziert werden. RITA hingegen induzierte Zelltod nur in einer bestimmten Gruppe von Zellen, weshalb der Transport von RITA ein potentieller Marker für die RITA-Sensitivität darstellen könnte. Zusammenfassend konnte in der verwendeten Zellauswahl sowohl nach Nutlin-3-, als auch nach Cisplatin- oder RITA-Behandlung ein Einfluss von wtp53 für die Sensitivität nachgewiesen werden. Allerdings konnten durch Cisplatin und RITA auch Effekte unabhängig von p53 vermittelt werden. Interessanterweise führte die Behandlung mit RITA zu einer von der p53-Superfamilie und von der Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges unabhängigen Regulation von p53-Zielgenen. Dementsprechend können im p53-defekten System p53-Zielgene sowie typische p53-Funktionen durch die Aktivierung p53-unabhängiger Signalwege vermittelt werden.