The yeast endosomal/TGN-localized Ysl2p-Arl1p-Neo1p network: search for novel interaction partners

Abstract

Vesicle transport is crucial for the communication between the compartments of a eukaryotic cell during the internalisation of endocytosed material, secretion of proteins into the extracellular space and biosynthetic transport to the vacuole. During each transport step the budding, tethering and fusion of the vesicle has to be regulated by numerous proteins to ensure the specificity of transport. Arfs and Rabs, small GTPases of the Ras superfamily, are crucial switches in these processes due to their GDP/GTP cycle. Arf GTPases regulate mainly the budding of vesicles by recruiting adaptor proteins to membranes, which in turn ensure the packaging of appropriate cargo into the vesicle and enable the coat assembly. Ysl2p is a large protein, which has in the group of Dr. Birgit Singer-Krüger been shown to play a role in both the endocytic and biosynthetic route. Sequence analysis has further revealed homologies of Ysl2p to Sec7 family Arf GEFs. Due to this homology and the interaction of the N-terminus of Ysl2p, which contains the Sec7 domain, with the Arf-like GTPase Arl1p, Ysl2p was proposed to be a guanine nucleotide exchange factor for Arl1p. ARL1 was as well identified as a suppressor of the growth defect of Δysl2 cells. Arl1p localises to TGN and endosomes, where it recruits GRIP domain proteins to the membrane. Since GRIP-domain proteins are regarded as regulators of vesicle tethering, Arl1p was also proposed to be mainly involved in the tethering of vesicles. The NEO1 gene, which encodes an aminophospholipid translocase, has been identified as a second suppressor of the Δysl2 mutant. Same study of the Dr. B. Singer-Krüger group has demonstrated an in vivo interaction between Neo1p and Ysl2p. Thus, Neo1p is together with Ysl2p and Arl1p a further component of a common network. The work presented in this PhD thesis focussed on the role of Ysl2p within this network. Former analysis from the Dr. B. Singer-Krüger group have demonstrated strong diferencies between some protein levels of Δysl2- and wild type cells when compared by one-dimensional electrophoresis. In the present study, the protein composition of vacuoles isolated from Δysl2- and wild type cells were compared using two dimensional electrophoresis. Subsequently, the differing proteins were analysed by mass spectroscopy (collaboration with Dr. A. Sickmann group, Würzburg) to identify which protein levels are affected by the deletion. From all observable changes upon YSL2 deletion, the most prominent was the increase of the vacuolar levels of Erg6p. Additionally, a reduction of the vacuolar levels of some of the V-ATPase subunits and actin could be observed in Δysl2 cells. Subcellular fractionation experiments were performed to analyse if the changes of vacuolar levels of the V-ATPase were accompanied by changes in its distribution between TGN and endosomes. Additionally, other marker proteins of the TGN and endosomes were analysed for their distribution. However, no significant changes in the distribution of the analysed proteins could be observed. Interestingly, the cellular levels of Kex2p were significantly reduced in Δysl2 cells, which indicates on a possible role for Ysl2p in sorting of Kex2p on TGN/endosomes. For Ysl2p the subcellular distribution indicates a primarily early endosomal localisation. To identify novel interaction partners of Ysl2p, a two hybrid screen was performed in collaboration with the group of Dr. P. Uetz (Karlsruhe) with different subdomains of this large protein. Surprisingly, although several putative interaction partners of Ysl2p were identified in the screens, only the putative interactors of the central region of the protein (Ysl2PILT) could be confirmed in my subsequent studies. Ent4p appears to be the most interesting candidate since its homologues Ent3p and Ent5p have recently been found to interact with Gga2p, a putative binding partner of Ysl2p. A weak interaction of Ent4p and Ysl2p could be detected by a GST-pull down but not by a co-immunoprecipitation experiment. An alternative approach to identify novel interaction partners of Ysl2p was a large scale immunoprecipitation of Ysl2p-TAP. Although Ysl2p could be enriched with high purity no additional band could be specifically co-purifed by Ysl2p-TAP. This is surprising, since in a similar study Gillingham et al. (2006) isolated the protein Dop1p equimolar to Ysl2p, suggesting that the two proteins exist in a complex. Possible explanation for the failure in the present study could be a false purification method, since cells were lysed by grinding under liquid nitrogen while Gillingham et al. used spheroblasts for the detection. To analyse the importance of different domains of the Ysl2p protein, a deletion series was generated, in which 100 to 900 amino acids from the C-terminus of Ysl2p were exchanged by the TAP-epitope and the corresponding effect on the cell growth was analysed. Interestingly, already the deletion of C-terminal 100 amino acids caused the same growth defect as the deletion of the complete YSL2 gene. Further, it was demonstrated by a co-immunoprecipitation experiment that Ysl2p interacts with itself and that the C-terminal 100 amino acids are crucial for this interaction. Thus, the dimerisation of Ysl2p by the C-terminus could be highly important for cellular function. Former study from the group of Dr. B. Singer-Krüger analysed the role of the APL translocase Neo1p within the Ysl2p-Arl1p network. There it was demonstrated, that at restrictive temperatures the temperature-sensitive neo1-69 mutant accumulates aberrant membrane protrusions within the cell. Interestingly, the same study showed that the deletion of the ARL1 gene restores the growth of the neo1-69 mutant at the restrictive temperature, possibly by preventing the accumulation of Arl1p and effectors at the aberrant membrane protrusions. To identify possible Arl1-effectors, the experiment was repeated in the present study with deletions of several known TGN/endosomal adaptors. While the deletion of GGA1 had no effect on the growth of the neo1-69 mutant and the deletion of AP-1 and AP-3 subunits caused only partial suppression, the deletion of the adaptor GGA2 could suppress the neo1-69 growth defect to the same extent as the deletion of ARL1. Analogous analysis with several small GTPases demonstrated that, while the deletion of Ypt GTPases YPT7 and YPT51 had no effect on the growth of the neo1-69 mutant, the deletion of ARF1 caused partial and deletion of ARL3 caused suppression comparable to the deletion of ARL1. The connection between Gga2p and the Ysl2-Arl1-Neo1 network indicated by genetical analysis was supported by indirect immunofluorescence analysis, which demonstrated that the deletions of either ARL1 or YSL2 caused a loss of punctuate structures in the Gga2p-HA staining while in some neo1-69 mutant cells an accumulation of Gga2p in the aberrant structures could be observed. Further, a genetic interaction of ARL1 with the GGAs as well as an interaction of the VHS-GAT domain of Gga2p with Arl1p and Ysl2p by a GST-pull down experiment could be demonstrated. Thus, Arl1p and its network seem to play a role not only in tethering as indicated by former analysis but as well in vesicle budding together with the adaptor protein Gga2p. Finally, the protein Tvp38p has earlier been demonstrated to interact with Ysl2p in a two hybrid assay and a co-immunoprecipitation. Interestingly, Miller et al., (2005) have recently demonstrated an interaction between Sys1p and Tvp38p in a split ubiquitin screen. Both interactions could be confirmed in the present study, the Ysl2p-Tvp38p interaction by a GST-pull down assay and the Sys1p-Tvp38p interaction by a co-immunoprecipitation experiment. Thus, Tvp38p appears to be a link between the networks Ysl2-Arl1-Neo1 and Sys1-Arl3-Arl1. That could be a hint for a common role of these proteins. In summary, the present study provides evidence that the Ysl2-Arl1-Neo1 network plays an important role in membrane recruitment of the adaptor Gga2p to membranes and thus may participate in vesicle budding processes. Further, Ysl2p may play a role in the localisation of Erg6p, which regulates one of the final maturation steps in ergosterol synthesis.

Die interne Kompartimentalisierung ermöglicht es der eukaryotische Zelle den Transport sowohl von extrazellulärem Material zur Vakuole/Lysosom als auch von sekretorischen Proteinen nach außen von zytosolischem Milieu zu trennen. Die meisten Transportschritte zwischen den Kompartimenten werden durch Vesikel ermöglicht. Arfs und Rabs, kleine GTPasen der Ras Super-Familie, sind dabei entscheidend für die Spezifität der Auswahl sowohl des Transportguts als auch der Zielmembran. Proteine beider Familien werden durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEF) aus der GDP- in die GTP-gebundene, aktive Form überführt, die Interaktion mit entsprechendem GEF entscheidet darüber hinaus an welche Membran die GTPase rekrutiert wird. Hauptaufgabe der Arf GTPasen liegt darin Adaptoren an die Membran zu mobilisieren, diese wiederum interagieren gleichzeitig mit Clathrin und den Proteinen, die als Ladung in den Vesikel eingeschlossen werden. Clathrinmoleküle bilden Netzwerke, die wiederum die Deformation der Membran bis zur endgültigen Abschnürung des fertigen Transportvesikels unterstützen. Ysl2p ist ein großes Hefe-Protein von 186 kDa, dessen Verlust zur Folge Defekte sowohl in der Endozytose als auch im Sortieren vakuolärer Enzyme hat. Sequenzanalysen zeigten Homologien zwischen Ysl2p und den Mitgliedern der Sec7 Familie der Arf GEFs auf, die zwar in der Sec7 Domäne selbst nur niedrig ist, sich dafür aber über die gesamte Länge des Proteins erstrecken. Gleichzeitig wurde das Arf-ähnliche Protein, Arl1p, bei der Suche nach Suppressoren der Δysl2 Mutante identifiziert. Die Interaktion zwischen dem N-Terminus von Ysl2p und Arl1p, die in vitro nachgewiesen werden konnte, unterstützt die These, dass Ysl2p ein GEF für Arl1p sein könnte. Weiterhin wurde das NEO1 Gen, das eine Amminophospholipid (APL) Translokase kodiert, als Suppressor der Wachstums- und Endozytosedefekte der Δysl2 Zellen identifiziert, sowie eine Interaktion zwischen Neo1p und Ysl2p mittels Koimmunopräzipitationsexperimenten nachgewiesen. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde in Analogie zu dem Netzwerk aus Arf1p, dem GEF Gea2p und der APL Translokase Drs2p vorgeschlagen, dass das Ysl2-Arl1-Neo1 Netzwerk an der Biogenese von Endosomen beteilig ist. Dabei soll Neo1p die APL auf die cytosolische Seite der Lipiddoppelschicht überführen und somit möglicherweise zu der Membrankrümmung beitragen. Gleichzeitig interagiert Neo1p mit Ysl2p, welches Arl1p aktiviert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit habe ich mich mit der Frage befasst, mit welchen weiteren Proteinen Ysl2p in diesem Prozess interagiert. In der Gruppe von Dr. B. Singer-Krüger konnte gezeigt werden, dass die Deletion des YSL2 Gens eine starke Fragmentierung der Vakuole verursacht und dass diese Fragmentierung mit starken Veränderungen der Proteinlevels in der Vakuole einhergeht, wie durch eindimensionale Elektrophorese gezeigt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit als erstes isolierte Vakuolen von Δysl2- und Wildtypzellen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und die Proteine, deren vakuolären Levels durch die YSL2 Deletion stark beeinflusst wurden, mittels Massspektoskopie bestimmt (Kollaboration mit der Gruppe von Dr. A. Sickmann, Würzburg). Von den Proteinen, von denen Informationen gewonnen werden konnten, am stärksten auffallende Protein wurde als Erg6p identifiziert, ein Protein das an der Synthese von Ergosterol beteiligt ist und als Folge der YSL2 Deletion stark an Vakuolen angereichert wird. Außerdem konnten Reduktionen der vakuolären Levels von Aktin und einiger V-ATPase Untereinheiten verzeichnet werden. Da die YSL2 Deletion zu einer Reduktion des vakuolären Levels der V-ATPase führt, wurde mittels Zellfraktionierung untersucht, ob sich in der Δysl2 Mutante die Verteilung der V-ATPase zwischen den TGN und endosomalen Kompartimenten verändert hat. Bei der Fraktionierung konnten jedoch weder für die V-ATPase noch für die meisten anderen untersuchten Markerproteine Veränderungen in der Verteilung nachgewiesen werden. Interessanterweise konnte in Δysl2 Zellen eine starke Reduktion des Kex2p-Levels nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass Ysl2p möglicherweise eine Rolle im Kex2p-Transport zwischen TGN und Endosomen haben könnte. Die subzelluläre Fraktionierung deutet außerdem auf eine primär frühendosomale Lokalisierung von Ysl2p. Um weitere Interaktionspartner von Ysl2p zu finden, wurde mittels eines robotisierten Verfahrens (Kollaboration mit der Gruppe von Dr. P. Uetz, Karlsruhe) eine Zweihybridanalyse mit verschiedenen Domänen von Ysl2p durchgeführt. Interaktionspartner wurden in der kompletten Genbank von S. cerevisiae gesucht und für mehrere Domänen gefunden. Erstaunlicherweise konnten nur die Interaktionspartner der mittleren Unterdomäne von Ysl2p (Ysl2PILT) bei meinen anschließenden Analysen bestätigt werden. Von den putativen Interaktionspartnern von Ysl2PILT war Ent4p von größtem Interesse, da kürzlich eine Wechselwirkung zwischen dessen Homologen Ent3p und Ent5p und Gga2p, einem potentiellen Bindungspartner von Ysl2p, aufgezeigt wurde. Eine schwache Interaktion zwischen Ent4p und Ysl2p konnte in vitro, jedoch nicht mittels Koimmunopräzipitation gezeigt werden. Ergänzend zu der Zweihybridanalyse wurde eine Immunopräzipitation von Ysl2p-TAP im Großansatz durchgeführt, in der Hoffnung weitere Interaktionspartner mittels Koimmunoprezipitation identifizieren zu können. Jedoch konnten keine spezifischen Banden in den Ysl2-Eluaten entdeckt werden. Dies ist umso erstaunlicher, da in einer ähnlichen Studie von Gillingham et al. (2006) das Protein Dop1p in äquimolaren Mengen isoliert wurde wie Ysl2p selbst, woraus geschlossen werden kann, dass Dop1p und Ysl2p als Komplex vorliegen. Der Grund für den Misserfolg in der hier präsentierten Arbeit könnte in der falsch gewählten Präparationsmethode liegen. Der Aufschluss wurde z.B. in dieser Studie durch Mörsern in flüssigem Stickstoff durchgeführt während Gillingham et al. sphäroblastierte Zellen durch Homogenisation aufgeschlossen haben, was möglicherweise die Wechselwirkung erhält. Bisher war nicht viel bekannt über die Relevanz der jeweiligen Unterdomänen von Ysl2p für die Proteinfunktion. Eine Deletionsreihe wurde in der vorliegenden Arbeit konstruiert, bei der 100 bis 900 Aminosäuren von C-Terminus von Ysl2p durch ein TAP-Epitop ersetzt wurden. Daraufhin wurde das Wachstum der jeweiligen Deletionsmutanten mit Wildtyp- und Δysl2-Zellen verglichen. Bemerkenswerterweise führte schon der Verlust von 100 Aminosäuren zu dem gleichen Wachstumsdefekt wie die Deletion des gesamten Gens. Folglich ist der C-Terminus von großer Bedeutung für die Ysl2p Funktion. Mittels Koimmunopräzipitation konnte in der vorliegenden Studie nachgewiesen werden, dass Ysl2p mit sich selbst interagiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass die C-terminalen 100 Aminosäuren für diese Interaktion entscheidend sind. Somit liegt die Vermutung nahe, dass die Dimerisierung von Ysl2p mittels C-Terminus entscheidend für dessen Funktion innerhalb der Zelle ist, möglicherweise als gerüstbildendes Protein an endosomalen/TGN Membranen. Bei der Analyse der Funktion der APL Translokase Neo1p wurde in einer vorherigen Studie der Gruppe von Dr. B. Singer-Krüger (Wicky et al., 2004) die neo1-69 Mutante untersucht, die unnatürliche Verlängerung der endosomalen Strukturen akkumuliert. Diese Akkumulation der endosomalen Strukturen könnte wiederum den schweren Wachstumsdefekt dieser Mutante verursachen. Interessanterweise supprimiert die Deletion von ARL1 diesen Wachstumsdefekt der neo1-69 Mutante, möglicherweise durch Verhinderung der Akkumulation der Arl1p-Effektoren in den unnatürlichen Verlängerungen der neo1-69 Mutante. Im Einklang mit diesem Modell, sollte die Deletion der Arl1p Effektoren einen ähnlichen Effekt auf das Wachstum der neo1-69 Mutanten haben. Folglich, um zu überprüfen ob weitere potentielle Arl1p-Effektoren in der neo1-69 Mutante akkumulieren, wurde der Einfluss der Deletionen einer Reihe von Adaptorproteinen, die am TGN/endosomalen Transport beteiligten sind, auf das Wachstum der neo1-69 Mutante untersucht. Im Einklang mit dem Modell, haben die Deletionen der Adaptoren signifikante Unterschiede im Suppressionsverhalten bezüglich der neo1-69 Mutante gezeigt. Während Deletion von GGA1 keinen Einfluss auf das Wachstum hatte und Deletionen von AP-1 und AP-3 Untereinheiten den Wachstumsdefekt leicht supprimieren, bewirkte die Deletion von GGA2 in der neo1-69 Mutante ein wildtypartiges Wachstum und somit dasselbe Suppressionsverhalten wie die Deletion von ARL1. Deletionen von einigen Arf und Ypt-GTPasen zeigte auch, dass nur die Deletion von Arf-GTPasen den Wachstumsdefekt der neo1-69 Mutante supprimieren. Während Deletionen von YPT7 und YPT51 keinen Einfluss auf das Wachstum von neo1-69 Zellen hatten, konnte die Deletion von ARF1 das Wachstum der Zellen zum Teil und Deletion von ARL3 genau wie ARL1 vollständig wiederherstellen. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit dem Modell in dem die Akkumulation der Vesikelknospungsmaschinerie für den Wachstumsdefekt der neo-69 Mutante verantwortlich ist. Da die Deletion von GGA2 die beste Suppression des Wachstumsdefekts der neo1-69 Mutante erreicht hatte, war es am wahrscheinlichsten, dass dieser Adaptor ein Arl1p-Effektor ist. Um eine mögliche Verbindung zu überprüfen wurde die Lokalisation von Gga2p in den Δysl2 und Δarl1 sowie der neo1-69 Mutante mittels indirekter Immunofluoreszenz untersucht. In der neo1-69 Mutante konnte für Gga2p gezeigt werden, dass in den meisten Zellen das punktierte Färbungsmuster verloren geht. In den restlichen Zellen konnte eine stärkere Assoziation von Gga2p mit Membranen beobachtet werden. Die Deletion von ARL1 und YSL2 hat einen vollständigen Verlust der punktierten Lokalisierung von Gga2p zur Folge. Folglich scheinen sowohl Neo1p als auch Ysl2p und Arl1p an der Rekrutierung von Gga2p zu Membranen beteiligt zu sein. GST-pull down Experimente konnten eine Interaktion zwischen der VHS-GAT Domäne von Gga2p sowohl mit Arl1p als auch Ysl2p nachweisen. Weiterhin konnte auch eine genetische Interaktion zwischen ARL1 und den GGAs gezeigt werden, die Trippelmutante Δarl1Δgga1Δgga2 zeigt ein deutlich schlechteres Wachstum als die Einzel- oder Doppelmutanten. Zusammengefasst deuten die Immunofluoreszenzen, sowie die genetischen und biochemischen Daten auf eine Einbindung des Adaptors Gga2p in das Ysl2-Arl1-Neo1 Netzwerk. Somit ist auch ein Hinweis auf eine Rolle des Ysl2-Arl1-Neo1-Netzwerks in der Vesikelknospung geliefert worden. Als letztes wurden die Interaktionen des Transmembranproteins Tvp38p mit Ysl2p und Sys1p untersucht. Die Interaktion zwischen Tvp38p und Ysl2p wurde bisher mit der Zweihybridanalyse sowie durch Koimmunopräzipitationen gezeigt, während die Interaktion von Tvp38p mit Sys1p aus einem Split-ubiquitin screen bekannt ist. Beide Interaktionen konnten bestätigt werden. Die Interaktion von Tvp38p mit dem N-Terminus von Ysl2p wurde in vitro mit einem GST-pulldown nachgewiesen. Die Interaktion zwischen Tvp38p und Sys1p konnte in vivo mittels Koimmunopräzipitation gezeigt werden. Diese beiden Nachweise liefern einen gemeinsamen Interaktionspartner für Komponenten der Ysl2-Arl1-Neo1 und Sys1-Arl3-Arl1 Netzwerke und somit einen Hinweis auf die Möglichkeit einer gemeinsamen Funktion. Zusammenfassend kann gefolgert werden, dass das Ysl2-Arl1-Neo1 Netzwerk eine Rolle im Prozess der Vesikelknospung hat, indem es den Adaptor Gga2p zu Membranen rekrutiert. Ysl2p könnte auch eine Funktion in der Lokalisation von Erg6p haben, einer Komponente der Ergosterolsynthese-Maschinerie.