Studien zur Optimierung der Katalyse mittels der Monooxygenase CYP153AM.aq

Abstract

Die Fähigkeit von P450 Enzymen schwierige Oxidationsreaktionen mit hoher Spezifität und Selektivität zu katalysieren, macht diese Enzyme attraktiv für den Einsatz für viele biotechnologische Anwendungen. Durch die Herausforderung des Multienzymkomplexsystems bestehend aus Hämdomäne, Ferredoxin und Reduktase, als auch der meist niedrigen Aktivitäten und Stabilitäten sind noch wenige Applikationen bekannt. Diese Komplexität einer P450 Fusionsenzym katalysierten Reaktion wurde im Detail in dieser Arbeit studiert um Potentiale zu identifizieren, die zur Steigerung der Aktivität, Stabilität und Produktivität führen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden dabei Ansatzpunkte zur Optimierung auf der Enzymebene untersucht. Bioinformatische Verfahren wurden für die Identifizierung von Aminosäurepositionen in der Häm- als auch der Reduktasedomäne genutzt, welche mittels Mutagenese modifiziert wurden und die resultierenden Varianten sowohl in vitro als auch in vivo im Labormaßstab getestet wurden. Zur genaueren Beschreibung des terminal hydroxylierenden P450 Enzyms CYP153AM.aq wurde in dieser Arbeit in Kooperation mit Prof. Dr. Gideon Grogan, University of York, die Kristallstruktur von CYP153AM.aq aufgeklärt. Einige charakteristische Merkmale konnten im Vergleich zu beschriebenen Struktur-elementen von P450 Enzymen identifiziert werden. Dazu zählen das Fehlen der B‘-Helix und eine verlängerte F-Helix respektive ein verkürzter FG-Loop. Weiterhin konnte anhand der Kristallstruktur dargestellt werden, dass die aktive Tasche einem ~ 20 Å langen Trichter ähnelt, dessen oberer Durchmesser ca. 12 Å und der untere 9 Å misst. Diese Geometrie wird als Voraussetzung für die Selektivität für die terminale Position des Substrats angenommen. Mutationsstudien legen dar, dass bei einer Änderung des unteren Durchmessers (L354I) die Selektivität für die ω-1 Position bevorzugt wird. Durch das Aufklären der Kristallstruktur mit dem Produkt 12-Hydroxydodecansäure konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure in der aktiven Tasche vertikal positioniert ist und mit der Carboxygruppe eine Wasserstoffbrücke zu der Aminosäureseitenkette von Glutamin 129 bildet. Eine P450 Fettsäure-hydroxylase mit vergleichbar ausgeprägten Strukturelementen wurde bisher noch nicht beschrieben. Diese charakteristischen Strukturelemente führten zu der Annahme, dass Substratkanalverläufe in CYP153AM.aq sich von den bisher beschriebenen unterscheiden. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Joelle Pelletier, Université de Montréal, konnten durch molekular dynamische Simulationen gezeigt werden, dass die bisher als sekundär beschriebenen Substratkanäle in bakteriellen P450 Enzymen, die energetisch favorisierten Kanäle in CYP153AM.aq darstellen. Die Analyse von Energiebarrieren dieser Kanäle ermöglichte den Entwurf einer rationalen Mutantenbibliothek zur Steigerung der Aktivität gegenüber Fettsäuren als auch zur Erweiterung des Substratspektrums zu Alkanen. Dabei konnte dargelegt werden, dass die Verankerung der Carboxygruppe durch das Einführen einer Guanidinogruppe in Form eines Arginins für die Dodecan- als auch für die Octansäure verbessert werden konnte. Das Entfernen der funktionellen Gruppe an dieser Position durch die Substitution zu Alanin ermöglichte den Umsatz des Alkans n-Octan. Weitere Positionen, wie A231 und P135 konnten durch das Analysieren der Kristallstruktur und der Substratkanäle für eine Erhöhung der Aktivität um das 3-fache gegenüber Fettsäuren mit unterschiedlichen Kettenlängen identifiziert werden. So konnte S140R / A231G bzw. S140R / P135A als die besten Variante für Hexadecansäure, A231G für Dodecansäure und A231G / G307A für Octansäure identifiziert werden. Aufgrund des Multienzymkomplexes des P450 Fusionskonstrukts wurde auf Enzym-ebene die Hämdomäne als katalysierende Domäne als auch das Zusammenspiel dieser mit der Reduktasedomäne analysiert. Im Fokus stand hierbei die genaue Untersuchung der Elektronenübertragung von NAD(P)H über die Reduktase hin zur Hämdomäne mit dem Ziel diese zu optimieren, einhergehend mit einer gesteigerten Stabilität des Enzyms und einer Steigerung der Aktivität. In Kooperation mit Dr. Łukasz Gricman konnten Interaktionsflächen auf der Oberfläche (redox partner interaction sites (RPIs)) der Hämdomänen in Klasse II P450 Enzymen identifiziert werden, die für einen effizienten Kontakt zwischen den Domänen beschrieben wurden. Der Vergleich dieser Regionen zwischen Klasse I und Klasse II P450 Enzymen deckte Unterschiede der Eigenschaften der Aminosäure-seitenketten auf. So konnten Positionen in CYP153AM.aq identifiziert werden, die durch Mutagenese zu der entsprechenden Aminosäure geändert wurden. Ziel dabei war es, die Fusion zwischen der Klasse I Hämdomäne und der Klasse II Reduktase CPR zu verbessern. Eine 1,3-fach verbesserte Kopplungseffizienz, was als Quotient der Produktbildungsrate und der NAD(P)H Oxidationsrate definiert ist, und somit ein Maß für die Elektronenübertragung darstellt, konnte durch eine einzelne Punktmutation auf der Oberfläche von CYP153AM.aq erzielt werden. Weitere Fusionskonstrukte mit den Reduktasedomänen PFOR aus CYP116B3 als auch Rhf aus CYP116B2 wurden erstellt um ein Klasse VII P450 zu erhalten, was der natürlichen Konstellation von Hämdomäne und Reduktasepartnern in CYP153AM.aq. näher kommt. Beide dieser Reduktasen tragen FMN und FeS als prosthetische Gruppen. Der Fokus dieser Studie lag dabei eine erhöhte Aktivität und Stabilität einhergehend mit verbesserter Kopplungseffizienz zu erzielen. Die initialen Aktivi-täten von CYP153AM.aq-Rhf waren deutlich niedriger als in der Fusion CYP153AM.aq-PFOR. Letzteres wurde deshalb im Detail bezüglich der Linkersequenz studiert, die die Domänen Häm und Reduktase verbindet. Durch das Anpassen der Linkerlänge konnte in dieser Arbeit ein Fusionskonstrukt generiert werden, das eine um ~2-fache erhöhte initial rate in vitro gegenüber dem Substrat Dodecansäure und durch eine Kopplungseffizienz von 94 % eine um 67 % gesteigerte Stabilität der Hämdomäne und um 17 % gesteigerte Stabilität des gesamten Fusionskonstrukts aufweist. Im zweiten Teil wurden Stellschrauben zur Verbesserung der Ganzzell-Reaktion identifiziert und adressiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Fusions-konstrukt CYP153AM.aq-PFOR gegenüber einem System mit freien coexprimierten Reduktasen vorteilhaft ist. Als besonders große Einflussgröße konnte die Menge an aktivem Enzym identifiziert werden, weshalb die Expression im Detail untersucht wurde. Die besten Resultate (4-fache Steigerung) wurden bei einer Expression unter einem strikt regulierbaren Promotor erzielt. Auch die Erschwernis des Transports insbesondere von längerkettigen Fettsäuren über die Zellmembran wurde als Angriffspunkt für die Optimierung der Ganzzellreaktion erfasst. Durch die Regulation der Expression der fad Gene konnte neben dem Transport auch der Abbau der Fettsäuren und des hydroxylierten Produkts gesteuert werden. Die in vitro Mutagenese aus dem ersten Teil dieser Arbeit konnte generell auf das optimierte Ganzzellsystem übertragen werden. So stellt das in dieser Arbeit generierte P450-Fusionskonstrukt CYP153AM.aq-PFOR L2 kloniert in pBAD33 in E.coli BW25113ΔfadD einen interessanten Biokatalysator.

The ability of P450 enzymes to catalyse difficult oxidation reactions with high specificity and selectivity makes them attractive for the application in biotechnological processes. Just a few applications are known due to the challenge of the multi enzyme complex of heme domain, ferredoxin and reductase as well as the mostly low activities and stabilities. This complexity of a P450 fusion enzyme catalysed reaction was studied in detail in this thesis to identify potentials with the goal to improve the activity, stability and productivity. In the first part of this thesis approaches on the enzyme level were investigated. Therefore, bioinformatic methods were used to identify positions in the heme and reductase domain, which were modified and tested in vitro as well as in vivo in a lab scale. For a more precise description of the terminal hydroxylating enzyme CYP153AM.aq the crystal structure was solved in cooperation with Prof. Dr. Gideon Grogan, University of York. Some characteristic properties in respect to described structural elements of P450 enzymes could be identified. These include the missing B‘-helix and an elongated F-helix respectively a shortened FG-loop. With the crystal structure, it was able to show that the active site resembles a 20 Å long truncated cone with an upper diameter of 12 Å and a lower diameter of 9 Å. This geometry is supposed as requirement for the selectivity for the terminal position of a substrate in a catalysed reaction. Mutation studies demonstrate a favoured selectivity for the ω-1 position by varying the lower diameter (L354I). Solving the crystal structure with the product 12-hydroxy dodecanoic acid has revealed the vertical positioning of the fatty acid in the active site with a hydrogen bond between the carboxylic group and the amino acid side chain of glutamine 129. A P450 Enzyme with comparable structural elements wasn’t described so far. These characteristic structural elements led to the assumption of an alternative pass of substrate channels in CYP153AM.aq in respect to the so far described examples. Literature known secondary substrate channels of microbial P450 enzymes could be shown to be energetically favoured in CYP153AM.aq via molecular dynamic simulations in cooperation with Prof. Dr. Joelle Pelletier, Université de Montréal, Analysing these channels for energy barriers enabled the design of a rational mutant library for an enhanced activity towards fatty acids as well as expanding the substrate scope towards alkanes. By inserting a guanidine group as an arginine, the anchoring of a dodecanoic and octanoic acid could be improved. The removal of the functional group at this position by substituting with alanine enabled the conversion of the alkane n-octane. Further positions as A231 and P135 could be identified for the enhancement of the activity up to 3-fold towards fatty acids with different chain length by analysing the crystal structure as well as substrate channels. With this strategy, the best variant for hexadecanoic acid could be identified to be S140R / A231G resp. S140R / P135A for dodecanoic acid A231G and for octanoic acid A231G / G307A. Due to the multi enzyme complex of P450 enzymes among the analysis of the heme domain also the interaction between the latter with the reductase domain was studied. The primary objective was the precise examination of the electron transfer of NAD(P)H through the reductase domain to the heme domain with the goal to optimise it and consequently enhance the stability of the enzyme and increasing the activity. In cooperation with Dr. Łukasz Gricman redox partner interaction sites (RPIs) on the surface of the heme domain in class II P450 enzymes could be identified, which were described for an efficient contact between the domains. The comparison between class I and class II P450’s revealed differences in the properties of the amino acid side chains. This analysis helped identifying positions in CYP153AM.aq which were targeted by mutagenesis to optimise the fusion between the class I heme domain and the class II reductase CPR. An indicator for the electron transfer is defined as ratio between the product formation rate and the NAD(P)H oxidation rate. An enhancement of this coupling efficiency could be achieved by a single point mutation at the surface of CYP153AM.aq. Further fusion constructs with the reductase PFOR of CYP116B3 as well as Rhf from CYP116B2 were designed to get a class VII P450, which resembles the natural configuration of heme and reductase domain of CYP153AM.aq. Both reductases harbour an FMN and an FeS cluster as prosthetic groups. The focus was on enhancing the activity and stability along with optimised coupling efficiency. The initial rate of the fusion CYP153AM.aq-Rhf was lower than for the construct CYP153AM.aq-PFOR. The latter was therefore analysed for its linker sequence which connects the heme with the reductase domain. A fusion construct with ~2-times enhanced initial rate in vitro towards the model substrate dodecanoic acid and with an optimised coupling efficiency of 94 % an improved stability of 67 % for the heme domain and of 17 % for the whole fusion construct could be generated by the adjustment of the linker length. In the second part of this thesis parameters for optimising the whole cell reaction were identified and targeted. It could be shown that the fusion CYP153AM.aq-PFOR is more advantageous than coexpressed free reductases. As significant influencing factor the amount of active enzyme was identified, therefore the expression was studied in detail. The best results (4-fold increase) were achieved with a strong regulated promotor system. Further the difficulty of the transport in particular for longer chain fatty acids through the cell membrane was targeted to optimise the whole cell reaction. The regulation of the fad genes allowed an optimised transport as well as the prevention of the degradation of the fatty acids and its hydroxylated products. It was able to transfer the results of the in vitro mutagenesis of the first part of this thesis into the optimised whole cell fusion system. The generated P450 fusion construct CYP153AM.aq-PFOR L2 cloned in pBAD33 in E.coli BW25113ΔfadD is therefore also attractive for the application for the terminal hydroxylation of fatty acids.