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Open Access
DNA-Microarrays zur Identifizierung von pathoadaptiven Mutationen und Antibiotikaresistenzen in extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC)
(2007) Barl, Timo; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von DNA-Microarrays zur Genotypisierung von E. coli für die klinische Diagnostik. Im ersten Teil der Dissertation wurde ein DNA-Microarray zur Detektion der häufigsten pathoadaptiven Mutationen in der Bindeuntereinheit von Typ 1-Fimbrien (FimH), die das Pathogenitätspotential von extraintestinal pathogenen Escherichia coli-Stämmen (ExPEC) erhöhen, entwickelt. Dieser Microarray wurde verwendet, um die fimH-Varianten von 131 E. coli-Isolaten zu genotypisieren. Sämtliche Ergebnisse wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die insgesamt 16 nachgewiesenen verschiedenen Mutationen traten grundsätzlich in Kombination mit der dominanten Mutation V27A auf. Zusätzlich konnten für die hauptsächlich kommensalischen Gruppe A-Stämme die Mutation A202V bzw. für die pathogenen Gruppe B2-Stämme N70S, S78N und R166H als spezifische Marker identifiziert werden. In einem zweiten Teil wurde der vorbeschriebene gyrA-Microarray (Yu et al. 2004) zur Detektion der Fluorchinolonresistenz in E. coli überarbeitet und anschließend mit dem fimH-Microarray in einen Array integriert. Dabei wurden Mutationen an den Aminosäure-Positionen 83 und 87 berücksichtigt, die den ersten Schritt einer stufenweisen Akkumulation von Mechanismen darstellen, die zu einer klinisch relevanten Resistenz führen. Mit dem integrierten Array zur simultanen Detektion der relevanten Mutationen in fimH und gyrA wurden 141 Isolate genotypisiert. Dabei wurde in insgesamt 30 Isolaten mindestens eine resistenzauslösende Mutation nachgewiesen. Bei allen betroffenen Isolaten handelte es sich dabei ausnahmslos um Isolate aus Harnwegsinfektionen. Unter anderem konnte die phänotypische Chinolonresistenz von sechs klinischen Isolaten jeweils auf eine gyrA-Doppelmutation zurückgeführt werden. Zusätzlich wurde gyrA 255C als eine weitere Gruppe A-spezifische Position identifiziert. Die in dieser Arbeit verwendete Technologie der allelspezifischen Hybridisierung erwies sich als äußerst robust und leistungsfähig. Allerdings ist ein grundsätzliches Merkmal der Methode, dass für die unterschiedlichen Sondensätze häufig verschiedene Diskriminierungen zwischen Perfect Match- und Mismatchsonden beobachtet werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass der Einsatz einer mismatchspezifischen Endonuklease (Surveyor Nuclease) zu einer verbesserten Auflösung insbesondere für cytosinhaltige Fehlpaarungen bei einem Oligonukleotidarray führt. Abschließend betrachtet wurden in dieser Arbeit eine Reihe grundlegender Ergebnisse über die allelspezifische Hybridisierung gewonnen: (1) Stille Mutationen in der Ziel-DNA sowie die Einbaurate des Fluoreszenzfarbstoffs hatten einen signifikanten Einfluss auf die absolute Signalintensität, waren jedoch für die Diskriminierung der Varianten unerheblich. (2) Mit einem 22 min dauernden PCR-Programm konnte ausreichend Ziel-DNA amplifiziert werden, um eine eindeutige Genotypisierung durchzuführen. Dies reduzierte die Gesamtdauer des Assays auf dreieinhalb Stunden nach der DNA-Extraktion. (3) Für die Genotypisierung waren 1000 Genomäquivalente als Eingangsmaterial für die PCR ausreichend. (4) Schließlich wurde gezeigt, dass eine Mischpopulation aus zwei fimH-Genotypen bis zu einem 50fachen Überschuss der einen Variante aufgelöst werden konnte.