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Open Access
Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution
(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.
Open Access
Directed evolution of a bacterial alpha-amylase : towards enhanced pH-performance and higher specific activity
(2003) Bessler, Cornelius; Schmitt, Jutta; Maurer, Karl-Heinz; Schmid, Rolf D.
Alpha-Amylases, in particular, microbial Alpha-amylases are used widely in industrial processes such as starch liquefaction and pulp processes and more recently in detergency. Following the need for Alpha-amylases adapted to latter, we enhanced the alkali-activity of the Alpha-amylase from Bacillus amyloliquefaciens (BAA). The genes coding for the wild type BAA and the mutants BAA S201N and BAA N297D were subjected to error prone PCR and gene shuffling. For the screening of mutants we developed a novel, reliable assay suitable for high throughput screening based on the Phadebas® assay. One mutant (BAA 42) has an optimal activity at pH 7, corresponding to a shift of one pH unit compared to the wild type. BAA 42 is active over a broader pH-range than the wild type resulting in a fivefold higher activity at pH 10. In addition, the activity in periplasmic extracts and the specific activity increased 4 and 1.5 fold, respectively. Another mutant (BAA 29) possesses a wild type like pH-profile but reveals a 40-fold higher activity in periplasmic extracts and a nine fold higher specific activity. The comparison of the amino acid sequences of these two mutants with other homologous microbial Alpha-amylases revealed the mutation of the highly conserved residues W194R, S197P and A230V. In addition, three further mutations were found K406R, N414S and E356D, the latter being present in other bacterial Alpha-amylases.