Browsing by Author "Bonacker, Eckart"

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Open Access
Expression von DNA aus Bodenproben in Streptomyces für den Nachweis neuer Enzymaktivitäten
(2002) Bonacker, Eckart; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Genbanken aus Boden DNA in Streptomyces erstellt und auf Enzymaktivität gescreent. In diesem Zusammenhang wurden anfänglich mehrere Reportergene in Streptomyces exprimiert und verschiedene Methoden zur Transformation von Streptomyces im Hinblick auf ihre Anwendbarkeit und Effizienz getestet und optimiert. Als geeignetste Transformationsmethode erwies sich die Protoplastentransformation. Mit dieser Methode konnten Transformationseffizienzen von 10 exp 6 cfu/ µg DNA in Streptomyces lividans erzielt werden und damit ausreichende Werte für die Herstellung von Genbanken erhalten werden. Nach Aufreinigung genomischer DNA aus Böden wurde eine mehr als 18500 Klone umfassende Genbank in Streptomyces lividans erstellt und auf Lipase- bzw. Esteraseaktivität getestet. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Gene für die Catechol-2,3-dioxygenase und die BTL2- Lipase, die in verschiedenen Schritten der Aufreinigungsprodzedur von Boden-DNA eingebracht wurden, in einem anschließenden Screening aufgefunden werden können. Durch das Wiederfinden dieser Gene wurde die Durchführbarkeit dieser Methoden demonstriert. So konnte die Catechol-2,3-dioxygenase in einem von 2200 gescreenten Kolonien und die BTL2- Lipase in zwei von 3000 gescreenten Kolonien nachgewiesen werden. Weiterhin wurde auf den Einsatz von Streptomyceten in verschiedenen Assaysystemen hingearbeitet, die eine Verwendung von Mikrotiterplatten zum Hochdurchsatz Screening erfordern. Es konnte gezeigt werden, daß Mikrotiterplatten im 96er und 384er Format, sowohl bei Verwendung des halbsynthetischen R5 Mediums für die Kultivierung von Streptomyces, als auch für die qualitative und quantitative Durchführung von Farbassays im Kulturüberstand geeignet sind.