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Biomasse-Recycling einer Riboflavinfermentation: Lyse, Extraktherstellung und Fermentation
(2006) Bretz, Karlheinz; Syldatk, Christoph (Prof. Dr. rer. nat.)
Die industrielle Herstellung diverser Feinchemikalien wie Vitamine und Enzyme mittels Fermentation hat bereits in vielen Fällen die chemische Herstellung abgelöst. Obwohl die in diesen Prozessen produzierte Biomasse ein sehr hohes Energiepotential hat, wird sie meistens als Abfallprodukt entsorgt und in wenigen Fällen als Futtermitteladditiv oder Dünger verwendet. Betrachtet man die Zusammensetzung der Biomasse, so stellt man fest, dass diese Biomasse genau die elementare Zusammensetzung hat, die im Fermentationsmedium benötigt wird. Dies trifft auch auf die fermentative Riboflavinherstellung mittels B. subtilis zu. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die aus der Fermentation anfallende Biomasse zu verwerten, indem daraus ein Extrakt hergestellt wird, der wieder in der Fermentation eingesetzt werden kann. Hierdurch könnten die Prozesskosten erheblich gesenkt werden. Der Zellaufschluss zur Extraktherstellung erfolgt mittels Autolyse, deren optimale Bedingungen in einem pH Bereich von pH 6,5 bis 7,5 und einer Temperatur von 40 °C sind. Unter diesen Bedingungen können nach 24 h noch ca. 43 % der ursprünglichen Biotrockenmasse nachgewiesen werden. Da die endogenen Proteasen von B. subtilis für eine entsprechende Extraktqualität nicht ausreichend sind, müssen weitere Proteasen zugegeben werden. Durch ein Screening konnte für den pH-Wert von 6,5 die Kombination Protease N „Amano“, Promod 194P und Peptidase R und für den pH-Wert von 7,5 die Kombination Alcalase, Umimazyme und Protease P „Amano“ festgestellt werden. Die Zugabe der Proteasen bewirkt eine Beschleunigung der Autolyse, eine Erhöhung des Aufschlussgrades und eine Abnahme der Proteinkonzentration im Überstand. Von der ursprünglichen Biotrockenmasse werden bei pH 7,5 noch ca. 25 % und bei pH 6,5 noch ca. 35 % nachgewiesen. Trotz des erhöhten Lysegrades nimmt die Proteinkonzentration im Überstand bei pH 7,5 auf 16 % und bei pH 6,5 auf ca. 25 % der theoretischen Gesamtproteinkonzentration ab. Da ein vollständiger Abbau der freigesetzten hochmolekularen Proteine nicht erreicht wird, werden diese mittels Ultrafiltration (Ausschlussgrenze 10 kDa) entfernt um den erhaltenen Überstand in der Fermentation einsetzen zu können,. Die Induktion der Autolyse direkt nach Fermentationsende bietet einige Vorteile in Bezug auf das eigentliche Produkt Riboflavin. Während der Fermentation wird von B. subtilis der biosynthetische Vorläufer des Riboflavins, das 6,7-Dimethyl-8-Ribityllumazin, in geringen Mengen ins Medium ausgeschieden. Während der Autolyse wird dieses durch die freigesetzte Riboflavinsynthase zu Riboflavin umgesetzt und somit eine Ausbeutesteigerung von bis zu 6 % in Bezug auf die Riboflavin–Konzentration am Ende der Fermentation erzielt. Ein weiterer Vorteil dieser Vorgehensweise betrifft die Reinheit des Produktes Riboflavin. Durch die Zugabe der Proteasen bei der Autolyse, kann der Protein- und DNA-Gehalt signifikant gesenkt werden. In der Fermentation werden mit den Extrakten, die durch direkte Autolyse hergestellt werden, unabhängig vom pH-Wert der Autolyse, Ausbeuten von durchschnittlich 77 % erreicht. Wird vor der Induktion der Autolyse die Biomasse isoliert und gewaschen, so kann eine Ausbeute von durchschnittlich 93 % im Bezug auf die Standardfermentation mit Hefeextrakt erzielt werden. In allen durchgeführten Fermentationen mit den hergestellten Bacillus-Extrakten konnte ein langsameres Wachstum der Biomasse und ein um 1-3,5 h verzögerter Feed–Start im Vergleich zur Fermentation mit Hefeextrakt festgestellt werden. Nähere Untersuchungen hierzu ergeben, dass einerseits Stress Proteine und andererseits eine erhöhte Natriumkonzentration dafür verantwortlich sind.