Browsing by Author "Buziol, Stefan"

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Open Access
Verknüpfung molekularphysiologischer und reaktionskinetischer Werkzeuge zum Studium der in vivo Regulation des Glukosetransports von Saccharomyces cerevisiae
(2003) Buziol, Stefan; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
In der vorliegenden Arbeit wurde der Glukosetransport von Saccharomyces cerevsisiae auf reaktionskinetischer und molekularphysiologischer Ebene untersucht. Der Transport von Hexosen beruht bei S. cerevisiae auf dem Prozess der carriervermittelten erleichterten Diffusion. Durch die Expression geeigneter Transportproteine aus einem Set von 20 Genen kann sich die Zelle auf die Umgebungsbedingungen einstellen. Zunächst wurden die kinetischen Parameter für die Transportproteine Hxt1, Hxt5 und Hxt7 anhand von Einzelexpressionsmutanten in vivo geschätzt. Zusätzlich wurde der Wildtyp charakterisiert. Durch den Einsatz der aeroben fed-batch Kultivierung wurde der quasi-stationäre Zustand, der die Grundvoraussetzung für diese Untersuchungen ist, im Gegensatz zum steady-state bei Chemostat-Kultivierung nach kürzerer Zeit erreicht. Ausgehend von Zellpopulationen unter physiologisch definiertem Zustand wurden Glukosepulsversuche durchgeführt, und die Abnahme der extrazellulären Glukose verfolgt. Dieses Signal wurde mit dem Resultat einer numerischen Integration der dynamischen Bilanzgleichung verglichen, um unter Verwendung einer irreversiblen Michaelis-Menten Kinetik die kinetischen Parameter für die Einzelexpressionsmutanten und den Wildtyp abzuschätzen. Um den Transportschritt vollständig beschreiben zu können, ist es nötig, die Konzentrationen von intrazellulärer Glukose und Glukose-6-Phosphat (G6P) miteinzubeziehen. Es ist hierbei von Bedeutung, die initiale Aufnahmerate zu erfassen, da es während der Glukoseaufnahmemessungen zu einem Anstau intrazellulärer Glukose und infolgedessen einem Efflux derselben kommen kann. Dieser Efflux überlagert dann die Aufnahmemessungen. Während für die Messung von G6P geeignete Zellaufschluss und Extraktionsverfahren zur Verfügung standen, musste zur Erfassung des Signals intrazellulärer Glukose eine neue Methode entwickelt werden. Durch die Etablierung einer stopped-flow Probenahmetechnik wurde es möglich, die Dynamik der Konzentrationen intrazellulärer Glukose und von G6P im Millisekundenbereich zu erfassen. Die experimentellen Daten für die Dynamik von intrazellulärer Glukose und G6P können nun eingesetzt werden um ein Modell des Glukosetransports zu validieren, das auf einer reversiblen Influx-Efflux Kinetik basiert und eine Inhibition durch G6P berücksichtigt. In weiteren Untersuchungen wurde durch den Einsatz von Western blot Analysen die Dynamik der Hexosetransportproteine (Hxt1, Hxt5 und Hxt7) parallel als Antwort auf Veränderungen in der Glukosekonzentration verfolgt. Die gemessenen Konzentrationen für extrazelluläre Gukose, Ethanol und Biomasse wurden mittels Western blot Analyse mit der Expression der Transportproteine korreliert. Zuerst wurde eine glukoselimitierte Chemostat-Kultivierung auf einen batch-Prozess unter Glukoseüberschuss umgeschaltet. Dabei wurde eine Reprimierung des intermediäraffinen Hxt5-Proteins und eine Induktion von Hxt1, dem niedrigaffinen Transporter beobachtet. Die Expression des hochaffinen Hxt7-Transporters wird nach dem Umschalten zunächst verstärkt, um dann stark abzunehmen. Dies könnte einen Mechanismus der Zelle darstellen, auf die erhöhten Glukosekonzentrationen schnell zu reagieren. Beim zweiten Ansatz wurde eine Chemostat-Kultur durch multiple Glukosepulse dynamisch angeregt. Es konnte kein Einfluss der multiplen Stimuli auf die Expression der Transporter Hxt1 und Hxt5 nachgewiesen werden. Hxt7 hingegen zeigte deutliche Änderungen im Expressionsprofil. Es wurde eine Korrelation zwischen der Expression von Hxt7 und den spezifischen Raten für die Glukoseaufnahme und die Ethanolbildung beobachtet. Die Anwendung des Konzepts der "Metabolic control analysis" (Sensitivitätsanalyse) auf ein dynamisches Modell zur Beschreibung des anaeroben Wachstums von S. cerevisiae zeigte, dass die überwiegende Kontrolle des glycolytischen Flusses auf dem Transportschritt liegt. Somit sollte eine Erhöhung der Transportkapazität zu einem höheren glycolytischen Fluss führen. Unter Verwendung einer HXT5-Überexpressionsmutante (HXT5-Multicopyplasmid), der HXT5-Einzelexpressionsmutante sowie des Wildtyps wurden vergleichende Messungen des glycolytischen Flusses durchgeführt. Dazu wurden anaerobe Chemostat-Kulturen eingesetzt und die spezifischen Glukoseaufnahme- und Ethanolbildungsraten gemessen. Die Erhöhung der spezifischen Raten war unbefriedigend. Dies könnte an der durch die Überexpression verursachten "protein burden" liegen oder das Resultat von stark veränderten Poolkonzentrationen sein. Somit sollte ein zukünftiger Ansatz zur Steigerung der glycolytischen Leistung die Minimierung des "protein burden" sowie die Aufrechterhaltung der Homöostase berücksichtigen. Wie sich aus weiteren Simulationsergebnissen ergab, müssen dabei auch Enzyme berücksichtigt werden, die der Erhöhung der Poolkonzentrationen entgegenwirken.