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Open Access
Biothermodynamische Studien zur Adsorption monoklonaler Antikörper an chromatographischen Trennmaterialien
(2009) Dieterle, Michael; Hasse, Hans (Prof. Dr.-Ing.)
Monoklonale Antikörper sind therapeutische Proteine mit großem Potential in der modernen Medizin. Für ihre kostenoptimierte Produktion und ein rationales Design der technischen Trennprozesse ist ein Verständnis der Zusammenhänge zwischen den Prozessparametern, den Vorgängen in der Proteinlösung und dem Adsorptionsvorgang notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurden systematisch thermodynamische Untersuchungen zum Adsorptionsvorgang zweier monoklonaler Antikörper an CEC-Trennmaterialien sowie einige erste Untersuchungen an HIC-Trennmaterialien durchgeführt. Für die CEC-Trennmaterialien wurden in Batch-Experimenten Gleichgewichts-Adsorptionsisothermen bei unterschiedlichen pH-Werten, Salzkonzentrationen und unterschiedlichen Adsorbermaterialien aufgenommen. An diese Gleichgewichtsdaten wurden Modelle aus der Literatur angepasst. Zur reinen Korrelation der Meßwerte wurde sowohl das Langmuir-Modell als auch das Langmuir-Freundlich-Modell verwendet. Beide Modelle wurden verglichen und bewertet. Das Langmuir-Freundlich-Modell liefert erwartungsgemäß eine bessere Anpassung der Daten. Für die thermodynamische Betrachtung ist es jedoch aufgrund unphysikalischer Aussagen über den Zustand unendlicher Verdünnung ungeeignet. Zur Beschreibung der Abhängigkeit der Proteinadsorption von der Salzkonzentration wurden das steric mass-action (SMA) und das available area Modell (AA) bewertet. Beide liefern ähnliche Ergebnisse. Bei pH-Werten nahe dem isoelektrischen Punkt der Antikörper konnte die Abhängigkeit der Adsorption von der Salzkonzentration mit diesen Modellen sehr gut beschrieben werden. Die aus der Anpassung erstellten Modellparameter lassen sich physikalisch sinnvoll interpretieren. Die Antikörpernettoladung ist hier gering. Bei hohen Antikörperladungen, d.h. pH-Werte, die deutlich vom pI abweichen, treffen wesentliche Annahmen beider Modelle nicht mehr zu, sodass sich keine sinnvollen Korrelationen mehr erzielen lassen. Zusätzlich wurden in der Arbeit unterschiedliche Methoden zur Bestimmung der SMA- Modellparameter vorgestellt und untersucht. Einerseits können die Parameter durch Anpassung an Gleichgewichtsisothermen, andererseits direkt aus Chromatographieläufen bestimmt werden. Es zeigte sich eine sehr gute Übereinstimmung. Eine weitere Methode, um die thermodynamischen Grundlagen des Adsorptionsmechanismus zu untersuchen, ist die Mikrokalorimetrie. Durch Experimente mit einem isothermen Titrationskalorimeter konnte in Verbindung mit den Ergebnissen der Adsorptionsisothermen die spezifische Adsorptionsenthalpie als wichtige thermodynamische Größe bestimmt werden. hasd ist sowohl vom Beladungszustand des Adsorbers, als auch vom pH-Wert der Pufferlösung abhängig. Entlang der Isotherme ist hads nicht konstant und nimmt betragsmäßig ab. In Abhängigkeit der Adsorberbeladung adsorbieren die Antikörper auf unterschiedliche Art und Weise und nehmen andere Konformationen bzw. Orientierungen ein. Während bei neutralen pH-Werten hads negativ ist, ist die Adsorption im Sauren dagegen endotherm und entropisch getrieben, verursacht durch den großen Einfluss der Ionenwolke und den bei der Adsorption im Sauren verursachten Entropiegewinn. Die Kombination aus kalorimetrischen Experimenten und Adsorptionsisothermen ermöglicht eine Berechnung der thermodynamischen Parameter der Adsorption gads, hads,sads und Keq . Im Rahmen dieser Arbeit dienten statische Laserlichtstreumessungen zur Untersuchung der Wechselwirkungen der gelösten Antikörper. Dabei wurde der zweite osmotische Virialkoeffizient A2 sowie die massengemittelte Molmasse Mw ermittelt. Bei den Messungen wurden der pH-Wert, die Salzkonzentration und die Salzart variiert. Mit steigender Salzkonzentration nimmt der A2 ab und für hohe Salzkonzentrationen wird er negativ, da starke anziehende Wechselwirkungen überwiegen. Die Lichtstreumessungen wurden nach zwei unterschiedlichen Methoden durchgeführt. Zum einen im Batch-Modus (SLS-Batch-Modus) und zum anderen im online Modus bei dem ein Laser-Detektor in ein HPLC-System mit SEC-Säulen integriert ist (online SLS-SEC-Modus). Beide Methoden zeigen konsistente Resultate. Zur Auswertung wurden in beiden Fällen selbst entwickelte Programme eingesetzt, die auf dem Debye-Plot basieren. Die online Bestimmung des A2 war mit der kommerziell erhältlichen Software bislang nicht möglich. Das entwickelte Programm ermöglicht nun die Bestimmung aus einer einzigen Injektion in die HPLC mit nur einer Proteinkonzentration. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass thermodynamische Untersuchungen einen Beitrag zum besseren Verständnis der Proteinadsorption und der Vorgänge sowie der Wechselwirkungen in Proteinlösungen liefern. Dieses Wissen und die hier vorgestellten Methoden und Ergebnisse stellt eine Grundlage dar, um optimale Aufreinigungsbedingungen für ein Protein zu finden.