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Open Access
Recombinant production of human microsomal cytochrome P450 2D6 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
(2005) Dietrich, Matthias; Grundmann, Lisa; Kurr, Katja; Valinotto, Laura; Richter, Tanja; Schmid, Rolf D.; Lange, Stefan
Microsomal cytochrome P450 monooxygenases of the groups 1 – 3 are mainly expressed in liver and play a crucial role in phase 1 reactions of the xenobiotics metabolism. The cDNAs encoding human CYP2D6 and human NADPH-P450 oxidoreductase (CPR) were transformed into the methylotrophic yeast Pichia pastoris and expressed under control of the methanol inducible AOX1 promotor. The determined molecular weights of the recombinant CYP2D6 and CPR closely matched the calculated values of 55.8 and 76.6 kDa. CPR activity was detected by conversion of cytochrome c using isolated microsomes. Nearly all the recombinant CYP is composed of the active holo-enzyme as confirmed by reduced CO-difference spectra which showed a single peak at 450 nm. Only by co-expression of human CPR and CYP, CYP2D6 activity was obtained. Microsomes containing human CPR and CYP2D6 converted different substrates, such as 3-cyano-7-ethoxycoumarin, parathion, and dextrometorphan. The kinetic parameters of the dextrometorphan conversion closely matched those of CYP2D6 from other recombinant expression systems as well as from human microsomes. The endogenous NADPH-P450 oxidoreductase of Pichia pastoris seems to be incompatible with human CYP2D6, as expression of CYP2D6 without human CPR did not result in any CYP-activity. These recombinant strains provide a novel, easy-to-handle and cheap source for the biochemical characterization of single microsomal cytochromes as well as their allelic variants.
Open Access
Untersuchungen zur selektiven enzymatischen Hydroxylierung von Fettsäuren
(2008) Dietrich, Matthias; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
Ziel der vorgelegten Arbeit war die Untersuchung der enzymatischen Oxidation von Fettsäuren mit P450 Monooxygenasen. Dabei stand die Hydroxylierung von gesättigten Fettsäuren bzw. die Veränderung der Hydroxylierungsposition im Vordergrund. Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP) können molekularen Sauerstoff unter Aufnahme von zwei Elektronen aktivieren, wodurch ein Sauerstoffatom auf ein Substrat-Molekül übertragen wird, das andere Sauerstoffatom tritt bei der Reaktion in Form von Wasser aus. Die Elektronen für die Katalyse stammen von Cofaktoren (meist NADH oder NADPH) und werden mittels Elektronentransferproteinen auf das Hämeisen von P450 Monooxygenasen übertragen. Im Gegensatz zu den meisten anderen P450-Enzymen sind die Enzyme der Subfamilien CYP102A und CYP152A nicht von Redoxproteinen abhängig. Bei CYP102A-Enzymen handelt es sich um Fusionsproteine, die aus einer Monooxygenase- und einer FAD/FMN-enthaltenden Reduktasedomäne bestehen. Die Elektronen werden vom Cofaktor NADPH auf die Reduktase übertragen. Der schnelle Elektronentransfer im CYP102A-System führt bei der Umsetzung mit natürlichen Substraten (mittel- und langkettige Fettsäuren) zu den höchsten für P450 Monooxygenasen gemessenen Umsatzraten (>1000 min-1). Bei CYP152A1 handelt es sich genau genommen um eine Peroxygenase, die Wasserstoffperoxid als Elektronen- und Sauerstoffquelle nutzt. Mit langsameren Raten ist jedoch auch eine Katalyse mit molekularem Sauerstoff unter Verwendung von Elektronentransferproteinen möglich. Die CYP102A-Enzyme und CYP152A1 unterscheiden sich in der Regioselektivität der katalysierten Hydroxylierung. Während CYP102A-Enzyme Fettsäuren in subterminalen Positionen (omega-1 bis omega-3) hydroxylieren, erfolgt durch CYP152A1 die Hydroxylierung in alpha- und beta-Position. Die Verschiebung der Hydroxylierung der Capryl-, Caprin- und Laurinsäure nach gamma- und delta-Position würde in Hydroxysäuren resultieren, die direkte Vorläufer von Lactonen darstellen. Lactone sind interessante Geruchs- und Aromastoffe mit fruchtigem Charakter (Pfirsich, Kokosnuss). Für CYP152A1 wurden mit Hilfe des rationalen Protein-Designs verschiedene Mutanten erstellt, die eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Fettsäurebindestelle enthalten. Allerdings erwies sich nur der CYP152A1-Wildtyp als aktiv. Die erstellten Mutanten ließen sich zum Teil exprimieren, waren jedoch für die Umsetzung von Fettsäuren nicht produktiv. CYP102A7 ließ sich erfolgreich exprimieren und konnte in dieser Arbeit charakterisiert werden. CYP102A7 hydroxyliert Fettsäuren hauptsächlich in omega-2-Position, daneben werden noch omega-1- und omega-3-Position hydroxyliert. Daher ist CYP102A7 nicht für die Entwicklung einer gamma- oder delta-Hydroxylase prädestiniert. In Gegenwart des polaren Lösungsvermittlers DMSO zeigt CYP102A7 hohe Aktivität. Die Stabilität gegenüber Lösungsvermittlern ist besonders interessant für die Entwicklung von Prozessen mit hydrophoben Substraten. Neben Fettsäuren akzeptiert CYP102A7 auch Terpenoide als Substrate. Es wurden bereits zahlreiche Untersuchungen an CYP102A1 (P450 BM3) durchgeführt. Verschiedene Kristallstrukturen (mit und ohne Substrat komplexiert) machen das Enzym zugänglich für Methoden des rationalen Protein-Designs. Um die Regioselektivität der Fettsäurehydroxylierung von omega-1- bis omega-3-Position in Richtung gamma- und delta-Position zu verschieben, wurden Methoden der gerichteten Evolution und des rationalen Protein-Designs angewendet. Mit Hilfe eines in der Arbeit entwickelten Assays, mit dem über 6000 Mutanten analysiert wurden, war es nicht möglich eine wesentliche Verschiebung im Vergleich zum Ausgangsenzym zu erhalten. Allerdings wurden durch rationales Protein-Design Positionen identifiziert, die für eine zielgerichtete Veränderung des Produktmusters vorteilhaft sind. Mit der Mutante S72Y V78A F87A wurden, gemessen am Gesamtprodukt, 16% delta-, 5% gamma- und 9% beta-Hydroxylaurinsäure erzeugt.