Browsing by Author "Doderer, Kai"

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Open Access
Entwicklung und Evaluierung von Assaysystemen zur Identifizierung des Substratspektrums von Epoxidhydrolasen, Aufreinigung und Charakterisierung einer Epoxidhydrolase aus Rhodococcus ruber DSM44319
(2003) Doderer, Kai; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Das Ziel der Arbeit war die Suche nach neuen Epoxidhydrolasen (EC 3.3.2.3), die in rekombinanter Form als Biokatalysatoren verwendet werden können. Die Suche nach neuen Epoxidhydrolaseaktivitäten kann auf zwei Wegen erfolgen. Datenbanken, wie z. B. "GenBank", können auf DNA oder Protein Ebene durch Sequenzvergleiche mit Programmen, wie z. B. BLAST nach Sequenzen durchsucht werden, die bekannten Epoxidhydrolasen ähnlich sind. Im umgekehrten Fall kann eine unbekannte, aus einem Organismus isolierte Sequenz mit anderen verglichen werden und so die putative Funktion bestimmt werden. Im ersten Teil der Arbeit wurden drei putative Epoxidhydrolasen aus B. subtilis, C. glutamicum und M. charantia, die durch Sequenzvergleiche identifiziert wurden, untersucht. Durch die Analyse der Proteinsequenz kann nicht auf die Substratspezifität rückgeschlossen werden, deshalb musste die Funktionalität mit mehreren Epoxiden getestet werden. Dafür wurden zwei Produktnachweise in Mikrotiterplatten für vicinale Diole entwickelt. Der PSS (Periodatspaltung und Färbung mit Schiffschem Reagenz) und PSC (Periodatspaltung und Detektion mit Carboxyfluorescein) Assay. Mit dem PSS-Assay wurden die Produkte einer Periodatspaltung mit Pararosanilin in einer Farbreaktion nachgewiesen. Der PSS-Assay erlaubt den direkten Nachweis der 1,2-Diole in wässriger Lösung in Gegenwart von Zelllysaten. Der PSS-Test wurde mit vier Substrat/Produkt Kombinationen validiert. In allen Fällen konnte ein Diolgehalt von mindestens 5 µmol/ml sicher detektiert werden. Die Standardfehler lagen unter 8%. Mit dem PSC-Assay wurde das nach der Spaltung verbliebene Periodat mit Carboxyfluorescein nachgewiesen. Der PSC-Assay wurde mit sieben verschiedenen Epoxiden und ihren korrespondierenden 1,2-Diolen validiert und es konnten Standardfehler von unter 4 % und ein Detektionslimit von <1 µmol/ml bestimmt werden. Somit ist der PSC Test zum Variantenscreening geeignet. Mit diesen beiden Assaysystemen wurden die drei obengenannten, rekombinant in E. coli produzierten, Epoxidhydrolasen untersucht. Dabei konnte keine Epoxidhydrolaseaktivität gegen alle getesteten Epoxide nachgewiesen werden. L(+)-Weinsäure wird in einem Maßstab von 30000 t/a bei Preisen von 5 €/kg vorwiegend aus Rückständen der Weinerzeugung hergestellt. Die sich daraus ergebenden starken jahreszeitlichen Schwankungen machen eine von Naturstoff unabhängigen Zugang zu L(+)-Weinsäure attraktiv. R. ruber DSM44319 ist in der Lage cis-2,3-Oxirandicarbonsäure zu L(+)-Weinsäure zu hydrolysieren. Das für die Hydrolyse von cis-2,3-Oxirandicarbonsäure verantwortliche Enzym wurde aus R. ruber DSM44319 durch eine mehrstufige Aufreinigung mit einem Reinigungsfaktor von rund 450 isoliert. Das aufgereinigte Protein wurde charakterisiert und die Teile der Proteinsequenz bestimmt. Mit diesen Fragmenten konnte bei einer Datenbanksuche in den US Patenten eine Hydrolase aus R. rhodochrous LMPG-18079 gefunden werden, die dieselbe Reaktion katalysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass die patentierte Protein- und DNA-Sequenz aus R. rhodochrous LMPG-18079 und R. ruber DSM44319 identisch sind. Proteinsequenzvergleiche zwischen der R. ruber Sequenz mit bekannten Epoxidhydrolasen zeigten keine Ähnlichkeit. Jedoch zeigt diese Sequenz eine hohe Ähnlichkeit mit vielen Halogencarbonsäure Dehalogenasen. Damit konnte gezeigt werden, dass die Hydrolase aufgrund ihrer Proteinsequenz als Halogencarbonsäure Dehalogenase (EC 3.8.1.5) einzustufen ist, obwohl sie in ihrer Funktionalität einer Epoxidhydrolase entspricht.