Browsing by Author "Enzelberger, Markus"

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    Entwicklung von Werkzeugen zur Darstellung und Durchmusterung von Proteinbibliotheken
    (1999) Enzelberger, Markus; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)
    Die Zufallsmutagenese etabliert sich zunehmend als Methode zur Veränderung von Proteineigenschaften. In der vorliegenden Arbeit werden Methoden zur automatisierten Erstellung und Durchmusterung von so erzeugten Proteinbibliotheken beschrieben. Um die Durchmusterung der Bibliotheken mit Roboterunterstützung durchführen zu können, wurde ein Verfahren entwickelt, welches die Vereinzelung der Mutanten in Mikrotiterplatten erlaubt. Zu diesem Zweck wurde ein Vektor konstruiert, welcher neben dem mutierten Gen noch das green fluorescent Protein (gfp) trägt. Mit diesem Vektor transformierte E. coli konnten bereits 3 Stunden nach Transformation mittels eines Zellsorters detektiert und in Kompartimente einer Mikrotiterplatte abgelegt werden, wo sie identisches Wachstums- und Expressionsverhalten zeigten. Für den Nachweis von Epoxidhydrolase-Aktivität wurde ein Assay auf Basis von p-(4-Nitrobenzyl)-pyridin entwickelt. Der Test wurde im robotergestützten Hochdurchsatzscreening einer Streptomyceten-Stammsammlung validiert. Es gelang damit allerdings nicht in einer durch rationale und Zufallsmutagenese erzeugten Proteinbibliothek einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus Epoxidhydrolase-Aktivität nachzuweisen. Ebenfalls durch Zufallsmutagenese wurden neue Peptide für die Metallaffinitätschromatografie entwickelt. Ausgehend von einer bekannten Metallbindungsstelle einer ATPase aus Helicobacter pylori wurde das Sequenzmotiv HxHxxxCxxC mittels wobble Primer Technik variiert und an das gfp fusioniert. Die so entstandene Proteinbibliothek wurde mittels eines Laborroboters in Mikrotiterplatten auf die Bindungseigenschaften an Metallaffinitätsmatrizen untersucht. Es wurden Affinitätspeptide mit gegenüber dem (His)6-Tag deutlich verbesserten Eigenschaften gefunden. Die breite Anwendbarkeit des Affinitätspeptids konnte am Beispiel der Aufreinigung einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus, die sowohl in E. coli als auch in Streptomyces lividans exprimiert wurde, gezeigt werden.