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Der Citronellolstoffwechsel in Pseudomonaden - Funktionelle Zuordnung beteiligter Gene und deren Produkte
(2008) Förster-Fromme, Karin; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Citronellol und Geraniol sind in der Natur als Duftstoffe weit verbreitete azyklische Terpenoide, die aufgrund ihrer β-ständigen Methylgruppe nicht über β-Oxidation abgebaut werden können. In jüngster Zeit konnten zwei in den Citronellolabbau involvierte Gencluster in P. aeruginosa PAO1 identifiziert werden, das atu (acyclic terpene utilisation)- und das liu (leucine/isovalerate utilisation)-Gencluster (FÖRSTER-FROMME ET AL., 2006, HÖSCHLE ET AL., 2005). Bisher konnten nur die Gene der in den Citronellolstoffwechsel involvierten Carboxylasen funktionell identifiziert werden (HÖSCHLE ET AL., 2005). In dieser Arbeit wurden weitere Gene der Cluster funktionell zugeordnet. - In P. citronellolis wurde ein Gencluster (atuABCDEFGH) identifiziert und sequenziert, dessen Gene sehr hohe Identitäten zu den atu-Genen von P. aeruginosa PAO1 aufwiesen. Dieses Gencluster wurde als atu-Gencluster von P. citronellolis annotiert. Eine Insertionmutante in atuA zeigte, daß dieses Gen essentiell für den Citronellolabbau ist. - In P. citronellolis konnte anhand zweier Transposonmutanten in mqoB gezeigt werden, daß die Malat-Quinon-Oxidoreduktase (MqoB) eine essentielle Rolle beim Abbau von Terpenoiden spielt, da die Endprodukte des Citronellolabbaus in den Glyoxylatstoffwechsel eingehen und die Malat-Quinon-Oxidoreduktase ein essentielles Enzym dieses Stoffwechselweges ist. - In P. aeruginosa PAO1 konnte die Funktion der Citronellyl-CoA-Dehydrogenase AtuD zugeordnet werden. AtuD wurde exprimiert und gereinigt und eine spezifische Aktivität von 850 ± 37 mU/mg für den Umsatz von Citronellyl-CoA ermittelt. Der KM-Wert für Citronellyl-CoA beträgt 1,6 ± 0,3 µM. Das Reaktionsprodukt Geranyl-CoA wurde mit HPLC und Massenspektrometrie nachgewiesen. AtuD ist hochspezifisch für Citronellyl-CoA, da Isovaleryl-CoA oder Octanoyl-CoA nicht umsetzt werden. Durch 2D-Gelanalysen wurde eine weitere Acyl-CoA-Dehydrogenase als spezifisch beim Wachstum auf Terpenoiden erkannt und als PA1535-Genprodukt identifiziert. Das PA1535-Genprodukt wurde heterolog in E. coli exprimiert, gereinigt und die Substratspezifität bestimmt. Das Enzym setzte Citronellyl-CoA mit 2450 ± 26 mU/mg (KM-Wert 18 ± 1,1 µM) und Octanoyl-CoA mit 610 ± 10 mU/mg (KM-Wert 130 ± 9,8 µM) um. Isovaleryl-CoA stellt kein geeignetes Substrat dar. - In P. aeruginosa PAO1 wurde die Funktion der Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase LiuA zugeordnet. Gereinigtes LiuA setzte Isovaleryl-CoA mit 1620 ± 55 mU/mg (KM-Wert 2,3 ± 0,4 µM) um. Langkettige CoA-Thioester wie Citronellyl-CoA oder Octanoyl-CoA wurden nicht umgesetzt. - In P. aeruginosa PAO1 wurde das stromaufwärts des atu-Genclusters liegende Gen (PA2885) durch Insertionsmutangenese als Repressor des atu-Genclusters identifiziert (atuR). AtuR gehört zur TetR-Familie. In dem intergenischen Bereich zwischen atuR und atuA (280 bp) wurde eine Region mit Ähnlichkeit zu σ-70 Promotoren sowie partiell überlappend zwei perfekte inverted repeats gefunden. Heterolog exprimiertes und gereinigtes AtuRHis6 war in der Lage, in Gelshift-Experimenten spezifisch an den intergenischen Bereich zu binden. Für eine vollständige Bindung waren beide inverted repeats, nicht aber die -10- und die -35-Region notwendig. Citronellol, Geraniol, Citronellal, Geranial, Citronellsäure und Geranylsäure, nicht aber Leucin, Isovaleriansäure, 3-Methylcrotonsäure, Phytol und Eukalyptol verhinderten die Bindung von AtuR und stellen somit offenbar Effektoren von AtuR dar. - Mithilfe von Proteomanalysen wurde gezeigt, daß sechs von acht Atu-Proteinen und vier von fünf Liu-Proteinen spezifisch beim Wachstum auf azyklischen Terpenen, bzw. Isovalerat gebildet werden. Des weiteren wurden 16 weitere Proteine identifiziert, die vermutlich ebenfalls am Citronellolstoffwechsel beteiligt sind. - Bei P. aeruginosa POA1 wurden alle Gene des atu-Genclusters durch Insertion von pKnockout-G (WINDGASSEN ET AL., 2000) inaktiviert. Es wurde gezeigt, daß fünf der atu-Gene (atuA, atuB, atuC, atuD, atuF) essentiell für den Citronellolabbau waren. Insertionsmutanten in atuE, atuG und atuH zeigten keinen Phänotyp.