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ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD): Untersuchungen von Komponenten zum Abbau glykosylierter und unglykosylierter Substrate
(2009) Fischer, Oliver; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
Die Funktion von Proteinen hängt von ihrer korrekten Struktur ab. In eukaryontischen Zellen existieren deshalb Protein Qualitätskontrollsysteme, die missgefaltete Proteine erkennen und abbauen können. Für neusynthetisierte sekretorische Proteine befindet sich eine solche Qualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum (ER) und wird allgemein als ER-abhängige Protein Qualitätskontrolle (ERQC) bezeichnet. Missgefaltete Proteine werden im ER über einen retrograden Transport zurück ins Zytosol transportiert und dort über das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Man nennt diesen ERQC-abhängigen Abbau von Proteinen die ER-assoziierte Degradation (ERAD). Diese Systeme sind evolutionär hoch konserviert. Man findet sie in allen Eukaryontenzellen von der Hefe bis zum Menschen. Ein für proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden leicht zugänglicher eukaryoter Modellorganismus ist die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Mehrere Studien mit dem ERAD-Modellsubstrat CPY* zeigten die Bedeutung der Glykane an Proteinen für die ER-assoziierte Degradation von missgefalteten glykosylierten sekretorischen Proteinen auf. In Wildtypzellen wird glycosyliertes CPY* mit einer Halbwertszeit von t1/2 = 20 min abgebaut; die entsprechend unglykosylierte Variante CPY*0000 wird stabilisiert mit einer Halbwertszeit von ca. t1/2 = 90 min. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die zwar verlangsamte Degradation von CPY*0000 noch eine von Schlüsselkomponenten des ERAD abhängige Degradation ist. Zunächst wurde in mehreren unabhängigen Pulse-Chase Analysen eine Stabilisierung von CPY*0000 in einem pre1-1 pre4-1 Stamm gefunden. Eine Stabilisierung von CPY*0000 wurde in weiteren Pulse-Chase Analysen mit einem delta-der3-Stamm entdeckt, der die für ERAD-L und -M Weg notwendige E3-Ubiquitin-Ligase Der3 depletiert. Zudem wurde in einer Pulse-Chase Analyse das Abbauverhalten von CPY*0000 in vakuolären Proteinasen defizientem Zellen untersucht. Die beiden ER lumenalen Proteine Yos9 und Htm1 (auch Mnl1 genannt) wurden auf Grund von ersten Studien als Lektine vermutet, die den Glykan-Status an glykosylierten sekretorischen Proteinen detektieren können. In dieser Arbeit wurden in vivo Bindungspartner von Yos9 nachgewiesen. In Immunopräzipitationsexperimenten wurden Bindungen von Yos9 zu seinem Substrat CPY* und zu ERAD Komponenten Cdc48, Der3, Htm1 und Kar2 gefunden. Die Bindungen von Yos9 zu Cdc48 und Der3 sind Hrd3 abhängig, nicht aber die Bindung zum Substrat, wie weitere Immunopräzipitationen zeigten. In weiteren Co-Immunopräzipitationen wurde auch eine Bindung von Htm1 zu der ER-α1,2-Mannosidase (Mns1) ausgeschlossen. Htm1 besitzt eine zu Mns1 homologe Mannosidase-Domäne. In dieser Arbeit wurden deshalb genetische Analysen mit Htm1 und Mns1 durchgeführt. Erstmals konnte ein genetischer Zusammenhang zwischen den beiden Genen gefunden werden: Die Gene MNS1 und HTM1 haben auf die Degradation von CPY* einen additiven Effekt. Mit verschiedenen Deletionstämmen wurden Pulse-Chase Analysen im Hinblick auf die Degradation CPY* durchgeführt. Zellen mit eine Deletion in den Genen MNS1 oder Htm1 zeigten jeweils nur noch eine Degradation von CPY* mit einer Halbwertszeit von ca. t1/2 = 90 min auf. Eine delta-mns1 delta-htm1 Doppeldeletion in den Zellen führte darüber hinaus zu einer fast vollständigen Stabilisierung von CPY*. Der delta-mns1 delta-htm1 Doppeldeletionsstamm wurde mit einem „high-copy“ Plasmid transformiert, das Htm1 kodierte. In Pulse-Chase Analysen wurde nun gezeigt, dass diese Überexpression von Htm1 in den Zellen den delta-mns1 Phänotyp hinsichtlich der CPY* Degradation nicht ändert. Analog wurde dieses Experiment mit überexprimierter Mns1 im delta-htm1 Deletionsstamm durchgeführt und nachgewiesen, dass auch eine Überexpression von Mns1 nicht den delta-htm1 Phänotyp ändert. Die Funktion von Usa1 im ERAD ist in Hinblick auf seine Substratspezifität widersprüchlich. Im Rahmen einer Kooperation mit der Gruppe von T. Sommer, MDC Berlin, wurde in dieser Arbeit der Abbau von CTG* in DF5-Stämmen in Abhängigkeit von USA1 untersucht. Es wurden der DF5-Stamm Wildtyp für USA1 und der DF5-Stamm delta-usa1 mit einer USA1 Deletion mit dem Plasmid, welches CTG* kodiert, transformiert. Mit den Transformanden wurden zwei unabhängige Pulse-Chase-Analysen durchgeführt. In beiden Versuchen zeigte sich eine deutliche verlangsamte Degradation von CTG* in den delta-usa1-Zellen im Vergleich zu den USA1-Wildtypzellen.