Browsing by Author "Flieger, Oliver"

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Untersuchungen zum unkonventionellen Sekretionsweg des Zytokins Makrophagen-migrationsinhibierender Faktor (MIF)
(2002) Flieger, Oliver; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Der Makrophagen-migrationsinhibierende Faktor (MIF) wurde erst kürzlich als Hormon, proinflammatorisches Zytokin und Glucocorticoid-Regulator wiederentdeckt. MIF spielt eine wichtige Rolle beim septischen Schock, akuten und chronischen Entzündungskrankheiten sowie bei der natürlichen und der erworbenen Immunantwort. Obwohl MIF keine hydrophobe N-terminale Signalsequenz besitzt, wird es aus Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, bestimmten Epithelzellen und endokrinen Zellen nach spezifischer Stimulation sezerniert. In der vorliegenden Arbeit wurden die biochemischen Eigenschaften von MIF als leaderless secretory-Protein untersucht, die subzelluläre Lokalisation in Monozyten beschrieben und der Export von MIF über einen alternativen, nicht-klassischen Sekretionsweg charakterisiert. Intrazelluläres und nach LPS-Stimulation exportiertes MIF werden weder in typischen murinen noch in humanen immunregulierten Zellen N-glykosyliert, obwohl das Protein zwei potenzielle N-Glykosylierungsstellen besitzt. Nach in vitro-Translation wird MIF weder in Mikrosomen translokalisiert noch dort posttranslational modifiziert. MIF scheint also nicht in den klassischen ER-Golgi-Sekretionsweg einzutreten. Der Export von neusynthetisiertem sowie vorgeformtem MIF folgt einer ähnlichen Kinetik. Diese bewirkt eine schnell einsetzende Ausschüttung bereits 2 h nach LPS-Stimulation, die für 7-8 h anhält. LPS scheint die MIF-Sekretion sowohl über die Transkription/Translation von MIF als auch über einen posttranslationalen Mechanismus zu stimulieren. In Immunzellen colokalisiert MIF nicht mit bekannten Markern des klassischen Sekretionsweges. Eine partielle Colokalisation scheint es nur mit dem LLS-Protein PDI zu geben, das trotz seiner vorherrschenden Lokalisation im ER auch extrazellulär nachgewiesen wurde. Inhibitoren des klassischen Sekretionsweges wirken eher stimulierend als inhibierend auf den MIF-Export, der bei der Ausschüttung von vorgeformtem MIF einem energie-unabhängigen Mechanismus folgt. Es scheint ausgeschlossen, dass MIF über recycling endosomes aus der Zelle transportiert wird. Da aber die Sekretion von MIF durch einen Stimulator der Exocytose verstärkt und durch 18°C-Temperaturblock reduziert wird, assoziiert MIF möglicherweise mit Vesikeln des späten sekretorischen Transportweges. Nocodazol, ein Inhibitor der Tubulin-Polymerisation, reduziert den MIF-Export über einen weiten Konzentrationsbereich, was darauf hinweist, dass für den Export ein intaktes Tubulin-Netzwerk notwendig ist. Andere Inhibitoren, die das Tubulin-Netzwerk der Zelle manipulieren, beeinflussen den MIF-Export dagegen nicht. Somit scheint Nocodazol spezifisch auf den alternativen Export von MIF aus der Zelle zu wirken. Am Export von MIF sind ABC-Transporterproteine beteiligt, die unabhängig von einer konstanten Energieversorgung durch die Zelle niedermolekulare Stoffe, Peptide und Proteine über Membranen transportieren können. Die ABCA1-Transporter-Inhibitoren Glyburid und Probenecid reduzieren den MIF-Export konzentrationsabhängig um 70-95 %, ohne die Ausschüttung des klassisch sezernierten proinflammatorischen Zytokins TNF-α zu beeinflussen. Inhibitoren, die auf andere Subfamilien der ABC-Transporter wirken, haben keinen Einfluss auf den MIF-Export, was auch hier auf einen MIF-spezifischen Mechanismus hinweist. Mit der Identifikation niedermolekularer Substanzen, die den MIF-Export inhibieren, könnten alternative Sekretionswege als bedeutende Zielstrukturen für den Einsatz von Therapeutika dienen. Nocodazol, Glyburid und Probenecid könnten potenzielle Basisstrukturen für das rationale Design von small molecule drugs liefern. Über den identifizierten Mechanismus können zukünftig assoziierte Proteine dieses Transportweges als weitere mögliche MIF-basierte Pharma-targets identifiziert und charakterisiert werden.