Browsing by Author "Fotin-Mleczek, Mariola"

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    Molekulare Mechanismen der pro-apoptotischen Kooperation zwischen TNF-R1 und Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie
    (2002) Fotin-Mleczek, Mariola; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)
    Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der apoptotischen Kooperation zwischen dem Todesrezeptor TNF-R1 und den Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie, insbesondere dem TNF-R2, aufzuklären. Es wurde hier gezeigt, dass die Art der zellulären Antwort, die vom TNF-R1 ausgeht, stark von der Dauer der TNF-Stimulation abhängen kann. So reicht ein TNF-Puls aus um den Transkriptionsfaktor NF-kB zu aktivieren, ist aber nicht hinreichend, um die apoptotische Zellmaschinerie in Gang zu setzen. Die Ko- und Vorstimulation des TNF-R2 konnten die TNF-vermittelte Apoptose-Induktion erhöhen und beschleunigen. Die Verstärkung der Apoptose korrelierte dabei mit der Zeitkinetik der TNF-R2-induzierten TRAF2-Depletion. Eine TNF-R2-Stimulation von 6 Stunden führte zu einer fast vollständigen Depletion von TRAF2 aus dem Zytoplasma, verstärkte den TNF-R1-vermittelten Zelltod dramatisch und inhibierte gleichzeitig die TNF-R1-induzierte NF-kB-Aktivierung zu 90%. Wurden die beiden TNF-Rezeptoren gleichzeitig aktiviert, so konnte noch immer eine beträchtliche Verstärkung der TNF-R1-induzierter Apoptose beobachtet werden, während die TNF-R1-vermittelte NF-kB-Aktivierung unbeeinflusst blieb. Mit Hilfe von der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die Stimulation der Nicht-Todesrezeptoren CD40 und TNF-R2 zur TRAF2-abhängigen Rekrutierung der anti-apoptotischen Moleküle cIAP1 und cIAP2 an die Rezeptoren führte. Dies zeigt, dass der TNF-R1 und die Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie nicht nur um TRAF2 sondern auch um die mit TRAF2 assoziierten Schutzproteine kompetieren können. Diese Kompetition bildet den Kern des Modells zur apoptotischen Kooperation der beiden TNF-Rezeptoren. Demnach kann die Stimulation des TNF-R2 die TNF-R1-induzierte Apoptose auf zwei Ebenen verstärken: über die Inhibierung der NF-kB-abhängigen Induktion von Schutzproteinen und durch die Inhibition ihrer Schutzwirkung auf der post-transkriptionellen Ebene durch Kompetition. In beiden Fällen wird die Ausbildung eines Caspase-8-aktivierenden TNF-R1-Signalkomplexes ermöglicht. In vivo werden die Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie auch durch membranständige Liganden aktiviert. Daher wurden im zweiten Abschnitt dieser Arbeit die Interaktionen zwischen TNF-R2, CD40 und ihren membranständigen Liganden analysiert. Unter Anwendung der Laser-Scanning-Mikroskopie und von Kokulturen konnte demonstriert werden, dass in Zell-Zell-Kontakten die Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie mit ihren membranständigen Liganden Superaggregate bilden. Diese Aggregate entstehen innerhalb von 30 Minuten nach dem Zusammentreffen zweier Zellen, von denen eine den Rezeptor und die andere den membranständigen Ligand exprimiert. Die Rezeptor-Ligand-Superaggregate bleiben über mehrere Stunden stabil, wobei sich ihre Form und Lage stets verändern. Im Weiterem wurde beobachtet, dass die Rezeptor-Ligand-Superaggregate signalfähige Rezeptor-Komplexe enthalten. So wurde z.B. TRAF2 in die TNF-R2/memTNF-Aggregate rekrutiert. Wurde der CD40 mit einem löslichen CD40-Ligand stimuliert, so wurde die Internalisierung und möglicherweise der Abbau des Rezeptors beobachtet, nicht jedoch nach der Stimulation mit dem membranständigen Ligand. Dies deutet darauf hin, dass sich die Qualität der Bindung zwischen dem Rezeptor und seinem membranständigen Liganden wesentlich von der Interaktion des Rezeptors mit den löslichen Reagenzien unterscheidet.