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Expressionsoptimierung und Produktion von Haloalkan-Dehalogenasen zur Umsetzung von 1,2,3-Trichlorpropan
(2007) Fritz, Christina; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h. c. )
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Herstellung von Haloalkan Dehalogena-sen zur biokatalytischen Umsetzung des prochiralen 1,2,3 Trichlorpropan zu dem (R) oder (S) Enantiomer des 2,3-Dichlor-1-propanol. Die Bereitstellung dieser En-zyme schließt sowohl eine Optimierung der heterologen Proteinexpression im jewei-ligen Wirtsorganismus, als auch die Produktion und Aufreinigung des Biokatalysa-tors ein. Die von der Firma DOW Chemicals bereitgestellten Haloalkan Dehalogenasen un-terscheiden sich im Wesentlichen hinsichtlich ihrer ee-Werte bezüglich des Produkts 2,3-Dichlor-1-propanol und im Hinblick auf ihr Expressionsverhaltens in Escherichia coli. Für die aus einem Bodenscreening stammenden Haloalkan Dehalogenasen DSD4 und DSD49 wird auf Grundlage von experimentellen Ansätzen das intrazellu-läre Expressionsniveau dieser Proteine signifikant erhöht. Weiterhin werden auf Grundlage von modellgestützen Ansätzen Ursachen für die Bildung von "Inclusion bodies" während der heterologen Expression dieser Haloalkan Dehalogenasen her-ausgearbeitet. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der fermentativen Produktion von Ha-loalkan Dehalogenasen in E. coli über eine Hochzelldichte- Kultivierung im 30 l Maßstab und dem anschließenden Downstream-Prozess der Biokatalysatoren. Das Ziel dieses Arbeitsschwerpunkts liegt darin, den Biokatalysator im halbtechnischen Maßstab möglichst kostengünstig und innerhalb kurzer Zeit herzustellen. Für die Etablierung des Gesamtprozesses wird eine Haloalkan Dehalogenase aus Rhodo-coccus rhodochrous (DhaA) eingesetzt. DhaA weist gegenüber den DSD Varianten bezüglich des Produkts eine geringere Enantioselektivität auf, zeichnet sich aber bereits zu Beginn der Arbeit durch ein hohes Expressionsniveau in dem Wirtsorga-nismus E. coli aus. Innerhalb des Downstream- Prozesses wird die "High Gradient Magnetic Fishing"-Technik eingesetzt. Dieses Verfahren ermöglicht, wesentliche Schritte eines klassischen Chromatographie-Aufreinigungsverfahrens zu umgehen, was zu einer Kosten- und Zeitersparnis führt. Mit Hilfe der Magnettrenntechnik lässt sich der Downstream-Prozess für Haloalkan Dehlogenasen auf die drei Arbeits-schritte des Zellaufschlusses, der Affinitätsaufreinigung mittels HGMF und der Kon-ditionierung des Biokatalysators über eine Ultrafiltration reduzieren.