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Optimierung von Pseudomonas putida für die Produktion niedermolekularer Verbindungen
(2013) Graf, Nadja; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)
Das Gram-negative Bakterium Pseudomonas putida ist aufgrund seines ausgeprägten Stoffwechsels für aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe in den letzten Jahren zu einem der wichtigsten Wirtsorganismen in der Biotechnologie geworden. Für die gezielte Manipulation seines Genoms stehen gentechnische Methoden zur Verfügung, die jedoch ineffektiv und nur schwer zu handhaben sind. Basierend auf der Toxizität des Antimetaboliten 5-Fluoruracil und der Wirkung der Uracilphosphoribosyl-Transferase wurde ein neues, effizientes Gegenselektionssystem für die Einführung genetischer Modifikationen etabliert. Damit konnte der Metabolismus von P. putida hinsichtlich der Produktion industrierelevanter Substanzen, wie Vanillin und Glyoxylsäure, erfolgreich beeinflusst werden. Unter Verwendung dieses Systems wurde der vollständig sequenzierte P. putida Stamm KT2440 für die Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin genetisch so modifiziert, dass mit ruhenden Zellen eine hohe Ausbeute und Produktivität erzielt werden konnte. Da die Deletion des Gens vdh für die Vanillin-Dehydrogenase nicht ausreichend war, um den Vanillin-Abbau zu verhindern, wurde mit dieser Mutante eine Transposonmutagenese durchgeführt. Hierbei führte die Inaktivierung des Gens modA, welches für einen Molybdat-Transporter codiert, zu einem Stamm, der nicht mehr auf Vanillin als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen kann. Durch zusätzliche Integration des starken tac Promotors konnte die Expression der chromosomalen Gene für die Feruloyl-CoA-Synthetase (fcs) und die Enoyl-CoA-Hydratase/Aldolase (ech) und damit die Umsatzrate von Ferulasäure zu Vanillin deutlich gesteigert werden. Weitere Optimierungen bezüglich geringerer Nebenproduktbildung führten zu einer molaren Ausbeute von bis zu 86% in nur 3 h. Dies stellt die höchste Produktivität dar, die bisher mit Pseudomonas Systemen beschrieben wurde. Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit für eine andere Arbeitsgruppe weitere Stämme konstruiert, mit denen Vanillin de novo aus Glucose bzw. Protocatechuat produziert werden soll. Um P. putida als Plattform für die Produktion von Glyoxylsäure aus Ethylenglycol zu etablieren, wurde der Metabolismus zweier P. putida Stämme, KT2440 und JM37, untersucht. Hierfür wurden in KT2440 verschiedene Gene deletiert und die erhaltenen Mutanten an andere Arbeitsgruppen übergeben, die auf dieser Basis weitere Analysen durchführen konnten. Hierbei konnten neben den Schlüsselenzymen auch Unterschiede zwischen den untersuchten Stämmen festgestellt werden. Während in JM37 die Expression der Gene für die Tartronatsemialdehydsynthase (gcl), Malatsynthase (glcB) und Isocitratlyase (aceA) durch Glyoxylsäure bzw. Ethylenglycol induziert wird, zeigt sich in P. putida KT2440 nur eine Induktion von aceA. Beide Stämme verwenden jedoch die periplasmatischen, Pyrrolochinolinchinon-abhängigen Dehydrogenasen PedE und PedH für den ersten Oxidationsschritt von Ethylenglycol. Mithilfe der erhaltenen Deletionsstämme konnte so der Ethylenglycol-Stoffwechselweg in P. putida aufgezeigt werden. Pseudomonas Stämme dienen neben Escherichia coli und Bacillus subtilis als Wirtsorganismen für die Produktion heterologer Proteine. Allerdings sind die bisher vorhandenen Expressionssysteme nicht so stark und gut reguliert wie in E. coli. Daher wurde ein neues, Methylethylketon-induzierbares Expressionssystem auf Basis der Promotorregion PmekA des mekAB Operons aus P. veronii MEK700 für P. putida und E. coli etabliert und charakterisiert. Der Transkriptionsstart von PmekA wurde bestimmt und dabei eine potentielle Stamm-Schleife-Struktur am 5’-Ende der mRNA entdeckt. Im Gegensatz zu etablierten Systemen zeigt das neue System Vor-teile hinsichtlich einer sehr niedrigen Basalexpression und einer hohen Induktions-rate. PmekA wird positiv durch MekR, einem Mitglied der AraC/XylS-Familie, reguliert. Die Expression unterliegt außerdem einer Katabolitrepression durch Glucose, wobei eine explizite Wirkung der globalen Regulatoren Crc und PtsN nicht beobachtet werden konnte. Da MekR nur in unlöslicher und damit inaktiver Form gewonnen werden konnte, wurde seine Bindestelle durch Sequenzanalysen näher charakterisiert. Durch den Vergleich mit bekannten Bindestellen anderer Mitglieder der AraC/XylS-Familie konnte der mutmaßliche Operator von MekR als eine Wiederholung der Sequenz CACCN5CTTCAA mit einer 6 bp langen Zwischenregion definiert werden. Modifikationen dieser Region bestätigten ihre Bedeutung für die Initiation der Transkription. Aufgrund der Lage des mutmaßlichen Operators, der mit der -35-Region überlappt, wird für PmekA eine Aktivierung der Klasse II vermutet.