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Open Access
Recombinant production of human microsomal cytochrome P450 2D6 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
(2005) Dietrich, Matthias; Grundmann, Lisa; Kurr, Katja; Valinotto, Laura; Richter, Tanja; Schmid, Rolf D.; Lange, Stefan
Microsomal cytochrome P450 monooxygenases of the groups 1 – 3 are mainly expressed in liver and play a crucial role in phase 1 reactions of the xenobiotics metabolism. The cDNAs encoding human CYP2D6 and human NADPH-P450 oxidoreductase (CPR) were transformed into the methylotrophic yeast Pichia pastoris and expressed under control of the methanol inducible AOX1 promotor. The determined molecular weights of the recombinant CYP2D6 and CPR closely matched the calculated values of 55.8 and 76.6 kDa. CPR activity was detected by conversion of cytochrome c using isolated microsomes. Nearly all the recombinant CYP is composed of the active holo-enzyme as confirmed by reduced CO-difference spectra which showed a single peak at 450 nm. Only by co-expression of human CPR and CYP, CYP2D6 activity was obtained. Microsomes containing human CPR and CYP2D6 converted different substrates, such as 3-cyano-7-ethoxycoumarin, parathion, and dextrometorphan. The kinetic parameters of the dextrometorphan conversion closely matched those of CYP2D6 from other recombinant expression systems as well as from human microsomes. The endogenous NADPH-P450 oxidoreductase of Pichia pastoris seems to be incompatible with human CYP2D6, as expression of CYP2D6 without human CPR did not result in any CYP-activity. These recombinant strains provide a novel, easy-to-handle and cheap source for the biochemical characterization of single microsomal cytochromes as well as their allelic variants.
Open Access
Untersuchung der DNA-Reparaturwege in Streptomyces lividans TK64 anhand von Deletionsmutanten
(2012) Grundmann, Lisa; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)
Streptomyceten sind vor allem wegen ihres ausgeprägten Sekundärstoffwechsels bekannt (z.B. Antibiotikaproduktion). Ihr Lebenszyklus ist komplex und beinhaltet ein Sporenstadium. Das lineare Genom ist mit über 8 Mb außergewöhnlich groß. Ebenso ungewöhnlich ist die hohe Frequenz von spontanen Deletionen. Ziel dieser Arbeit war es ein besseres Verständnis für die DNA-Reparatur bzw. Rekombination und chromosomale Stabilität in Streptomyceten zu erhalten. Dazu wurden von S. lividans Mutanten erstellt, bei denen jeweils ein oder mehrere Gene eines bestimmten DNA-Reparaturweges deletiert wurden. Insgesamt wurden siebzehn verschiedene Deletionsmutanten auf ihre chromosomale Stabilität hin untersucht. Des Weiteren wurde die Überlebensfähigkeit dieser Mutanten nach der Mutagenese mit vier verschiedenen Mutagenen untersucht, jeweils im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64. Aus dem DNA-Reparaturweg der Prävention und Reversion von DNA-Schäden wurden die Gene der dUTPase und von AlkB deletiert. Die Basenexzisionsreparatur betreffend wurden die Gene von vier DNA-Glykosylasen und das Gen der Exonuklease III deletiert. Alle diese Deletionsmutanten zeigten keine veränderte chromosomale Stabilität. Nach der Behandlung mit einem methylierenden Mutagen zeigten nur die exoIII Mutanten eine signifikant reduzierte Überlebensrate. Unerwartet war dagegen die signifikant veränderten Überlebensraten der Mutanten (außer der dut Mutante) bei Mutagenen, welche nach der Theorie die Nukleotidexzisionsreparatur und/oder die Rekombinationsreparatur ansprechen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Enzyme auf der einen Seite keine zentrale Stellung in ihrem Reparaturweg einnehmen bzw. durch redundante Systeme kompensierte werden können. Auf der anderen Seite deuten die Ergebnisse auf eine unvermutet starke Vernetzung der Reparaturwege hin. Die Nukleotidexzisionsreparatur spielt in der Zelle eine sehr wichtige Rolle. Nach der Deletion von uvrB war die chromosomale Instabilität signifikant erhöht. Die Überlebensfähigkeit der Zellen war zudem nach der Behandlung mit Mutagenen, welche die Nukleotidexzisionsreparatur erfordern, stark reduziert. Streptomyceten stehen für die ersten Schritte der Rekombinationsreparatur bzw. der homologen Rekombination nur die Gene des RecFOR-Weges zur Verfügung. Es fehlen die Gene recB und recC für den RecBCD-Weg, der in E. coli die zentrale Rolle spielt, oder das alternative System AddAB, wie es in B. subtilis vorkommt. Die Ergebnisse zeigten, dass der RecFOR-Weg essentiell für die chromosomale Stabilität und die Rekombinationsreparatur ist. Schon ein Drittel der gebildeten Sporen der recF bzw. recO Mutanten war genetisch verändert, und die Überlebensfähigkeit der Zellen war bei allen Mutagenese-Versuchen drastisch reduziert. RecD spielt dagegen ohne RecB und RecC keine wichtige Rolle in einem der DNA-Reparaturwege, da sich eine Deletion von recD nicht signifikant auswirkte. Die Enzyme RecG und RuvABC sind in der postsynaptischen Phase der Rekombinationsreparatur von zentraler Bedeutung. Die Ergebnisse deuten auf eine Aufgabenteilung zwischen diesen beiden Systemen hin. Die alleinige Auflösung von DNA-Überkreuzungsstrukturen erfordert RuvABC. Wird dagegen eine Verschiebung der Überkreuzungsstruktur benötigt, oder findet eine Regression der Replikationsgabel statt, so ist RecG beteiligt. Die Helikase RecQ dürfte an mehreren DNA-Reparaturwegen beteiligt sein. Die chromosomale Instabilität war bei den recQ Mutanten leicht erhöht. RecQ kann zusammen mit der 5´-3´-Exonuklease RecJ 3´-DNA-Überhängen für die homologe Rekombination bereitstellen. In Streptomyceten fehlt recJ. Eine alternative 5´-3´-Exonuklease konnte noch nicht zugeordnet werden. Die Untersuchungen zeigten ferner, dass RecN bei der Aufrechterhaltung der chromosomalen Integrität und bei der Rekombinationsreparatur beteiligt ist, wenn auch von untergeordneter Bedeutung. Gene für das nicht-homologe Verbinden von Enden konnte in S. lividans TK64 durch Sequenzvergleiche nachgewiesen werden. Die Deletion von einem zu ku orthologen Gen und der benachbart kodierten Ligase zeigte jedoch keine Auswirkungen. Die Deletion von sbcCD verbesserte die Überlebensfähigkeit gegenüber manchen Mutagenen, erhöhte jedoch die chromosomale Instabilität. Eventuell verschlechtert die 3´-5´-Exonukleaseaktivität von SbcCD im Ausgangsstamm die Bereitstellung von 3´-DNA-Überhängen für die homologe Rekombination. Streptomyceten zeigen in ihrer Genausstattung bezüglich der DNA-Reparatur und der Reaktion auf Mutagene viele Gemeinsamkeiten aber auch einige Unterschiede mit den bisher darin sehr intensiv untersuchten Bakterien wie E. coli, D. radiodurans, B. subtilis oder M. tuberculosis. Insbesondere bleibt noch zu klären, welche Enzyme für die ersten Schritte der Rekombinationsreparatur bzw. der allgemeinen homologen Rekombination verantwortlich sind (Herstellung der 3´-DNA-Überhänge).