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Neuartige retrovirale Vektorsysteme für die Gentherapie: Entwicklung in Suspension wachsender Verpackungszellinien
(2000) Gutjahr, Thorsten S.; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Mit den zur Zeit verfügbaren adhärenten Verpackungszellinien ist die Produktion retroviraler Vektoren sehr begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, retrovirale Verpackungszellinien zu entwickeln, die in Suspension wachsen und ein 'scale-up' der Vektorproduktion ermöglichen. Es wurde gezeigt, daß Suspensionszellinien fähig sind Retrovirusvektoren transient zu produzieren, doch aufgrund ihrer schlechten Transfizierbarkeit es schwierig ist, eine genügend hohe und stabile Expression der viralen Strukturproteine, sowie des rekombinanten Virusgenoms zu erzielen. Aus diesem Grund wurden adhärente Verpackungszellinien an Suspensionswachstum adaptiert. Dazu wurde eine sichere und hoch effiziente HEK293-Verpackungszellinie hergestellt. Diese sowie die HT1080 abgeleitete FLYA13 wurden unter Verwendung serumfreier Medien an Suspensionswachstum adaptiert. Die in Suspension wachsenden Zellinien waren weiterhin fähig Virusvektoren zu produzieren, wobei die FLYA13- sehr hohe, die HEK293-Suspensionsverpackungszellinie niedrigere Virustiter erzielten. Es wurde gezeigt, daß diese Unterschiede zum Teil auf den verwendeten Medien beruhten. Durch Verwendung optimierter Medien und Kulturbedingungen sollte daher eine Steigerung der Vektorproduktion möglich sein. Neben der Herstellung von Suspensionsverpackungszellinien wurden Studien zum Verhalten von Verpackungszellinien in Langzeitkultur durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß eine Verpackungszellinie im Laufe der Kultivierung immer mehr Kopien an Provirusintegraten hinzubekommt. Die Vermehrung der rekombinanten Provirusintegrate könnte durch retrovirale Mechanismen innerhalb der Zelle und/oder auf Reinfektionen der Produzentenzellen mit den von ihr selbst gebildeten rekombinanten Virusvektoren beruhen. Das solche Reinfektionen möglich sind, wurde in mehreren Experimenten demonstriert. Weiterhin wurde eine Abnahme der Virusproduktionsleistung einer retroviralen Verpackungszellkultur im Laufe einer Langzeitkultivierung festgestellt.