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Open Access
Aufbau humaner 3D-in-vitro-Testsysteme zur Risikobewertung von Nanomaterialien
(2009) Hampel, Martina; Brunner, Herwig (Prof. Dr.)
Die Nanotechnologie stellt eine der Schlüsseltechnologien dieses Jahrhunderts dar Parallel zur Erschließung neuer Möglichkeiten, die die Nanotechnologie bietet, müssen jedoch auch mögliche Risiken untersucht werden. Die dabei zurzeit noch am häufigsten eingesetzte Untersuchungsmethode von Nanopartikeln ist die Verwendung zweidimensionaler in vitro Zellkulturen. Zum Einsatz kommen hier jedoch meist Zelllinien. Die Versuchsansätze entsprechen damit nicht den Bedingungen im menschlichen Körper. Eine der in vivo Situation nähere und damit exaktere in vitro Untersuchungsmöglichkeit des Risikopotentials stellt der Einsatz dreidimensionaler Zell-Testsysteme dar. Mit diesen Modellen lassen sich die Strukturen von Körperbarrieren in vitro nachbilden, nanoskalige Partikel toxikologisch untersuchen und so die Ergebnisse auf den menschlichen oder tierischen Organismus übertragen. Insbesondere im Bereich der Nanotoxikologie ist die Verifizierung einer möglichen Penetration und Absorption der Partikel durch die Körperbarrieren wichtig. Der Respirationstrakt und die Haut stellen dabei wesentliche potentielle Eintrittspforten für Nanopartikel dar. In dieser Arbeit wurden daher humane Luftröhre und Haut als dreidimensionale in vitro Testsysteme aufgebaut, um eine mögliche Toxizität von Nanomaterialien zu untersuchen. Für den Aufbau des dreidimensionalen Hautmodells wurden sowohl primäre humane Keratinozyten und Fibroblasten, als auch die Keratinozyten-Zelllinie HaCaT eingesetzt. Parallel wurden vergleichende Studien an zweidimensionalen Zellkulturen durchgeführt, da sie im Bereich der Nanotoxikologie bislang noch als Standardtestsysteme eingesetzt werden. Diese zeigten deutliche Unterschiede zwischen den eingesetzten Keratinozyten und der Zelllinie HaCaT. Bei der Zelllinie konnte nur Interleukin 8 als Entzündungsmarker gemessen werden, während primäre Zellen, neben Interleukin 8 auch Interleukin 6, den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), sowie das Monozyten Entzündungsprotein 1alpha (MIP-1alpha) sezernierten. Damit wiesen die primären Zellen eine eindeutig höhere Reaktion bzw. verbesserte Zell-Zell-Kommunikation auf, als die Zelllinie HaCaT. Versuche an dreidimensionalen Hautmodellen zeigten keine erkennbare Penetration der Partikel, die sich als Agglomerate auf der Hornschicht absetzten. Die Zelllinie zeigte jedoch im Vergleich eine überschießende Stressreaktion auf die Nanopartikel. Neben der Haut stellt der Respirationstrakt eine sehr wichtige Körperbarriere in Bezug auf die Nanotoxikologie dar. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war daher der Aufbau eines 3D in vitro Tracheamodells. Durch die Neuentwicklung und Optimierung eines Differenzierungsmediums ließen sich primäre Zellen in 2D-Zellkulturen gezielt zur Ausbildung funktioneller Zilien anregen, die für die mucoziliäre Reinigungsfunktion der Trachea essentiell sind. Gleichzeitig wurde ein Bioreaktor entwickelt, mit dem sich zum einen die Zellkultur mit Nährmedium versorgen, zum anderen aber auch die Respiration nachstellen lässt. Gleichzeitig waren tracheaspezifische Marker für schleimproduzierende Becherzellen, zilientragende Epithel-Zellen, sowie Tight Junctions nachweisbar. Erste nanotoxikologische Versuche mit dem 3D-Tracheamodell zeigten keine relevanten Tendenzen. Klassische Untersuchungsmethoden zur Nanotoxizität sind jodoch zum einen nur auf Monolayer-Kulturen ausgelegt und zum anderen im Bereich der Nanotoxikologie nicht anwendbar. Kohlenstoffbasierte Nanopartikel interagieren mit den Proteinen aus den Assays und erzeugen dadurch falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse. Ein Teilaspekt dieser Arbeit war daher die Etablierung neuer Methoden zur Testung der Nanotoxizität, so konnte die globale Genexpressionsanalyse an primären Keratinozyten untersucht werden. Bereits bei der Untersuchung eines Viertels des Transkriptoms waren Unterschiede der Expressionsmuster der behandelten Proben und der Referenz erkennbar. Spezifische Marker der Keratinozyten, die für die Ausbildung der schützenden Hornschicht zuständig sind, wurden grundsätzlich bei den mit Nanomaterialien behandelten Proben herabreguliert. Die Zellen, die mit Titandioxid in Kontakt gebracht wurden, zeigten zusätzlich im Vergleich zu den mit Carbon Black oder Carbon Nanotube behandelten Zellen eine Einschränkung der Zellproliferation, sowie Adhäsion. Bei den mit Carbon Nanotube behandelten Zellen konnten Genexpressionsmuster identifiziert werden, die für eine Einschränkung des Zellzyklus und ein Defizit in der Quervernetzung von Kollagenstrukturen sprechen. Als weitere Untersuchungsmethode zur Untersuchung der Nanotoxizität wurde die nichtinvasive Raman-Spektroskopie eingesetzt. Mit ihr konnten nach der Behandlung der 3D-Hautmodelle mit den verschiedenen Nanomaterialien bereits unterschiedliche Reaktionen der Zellen nachgewiesen werden. Die globale Genexpressionsanalyse und die Raman-Spektroskopie sollten daher als innovative Werkzeuge für die Nanotoxikologie weiterentwickelt werden.