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Open Access
Das Streptomyces coelicolor A3(2) Plasmid SCP2* : Ermittlung der vollständigen Sequenz und daraus abgeleitete Funktionen
(2003) Haug, Iris; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)
SCP2 war das erste aus Streptomyces coelicolor A3(2) isolierte zirkuläre Plasmid, ein Fertilitätsfaktor ähnlich dem F-Plasmid aus Escherichia coli mit einer Kopienzahl von eins bis vier Plasmiden pro Chromosom. Das in dieser Arbeit untersuchte SCP2*-Plasmid ist ein spontan aufgetretenes Derivat von SCP2, welches sich durch erhöhte Fertilität und Mobilisierung chromosomaler DNA auszeichnet. Beide Plasmide sind seit langem Grundlage wichtiger Vektoren in der Streptomyceten-Genetik, die sich vor allem durch ihre Fähigkeit auszeichnen, große, insertierte Fragmente stabil weiterzugeben. Die Gesamtsequenz von SCP2* wurde ermittelt und ist in der GenBank unter der Nummer AL645771 hinterlegt. Teilsequenzen waren bereits vorher von anderen publiziert worden. Bei der Analyse der 31317 bp langen Sequenz von SCP2* wurden 34 offene Leserahmen identifiziert, deren abgeleitete Proteinsequenzen von 31 bis 710 Aminosäuren reichen. Den meisten dieser Proteine kann keine bekannte Funktion oder Verwandtschaft zu anderen Proteinen zugeordnet werden. Drei funktionelle Regionen waren bereits vorher identifiziert worden: die Stabilitäts-, die Transfer- und die Replikationsregion. Des Weiteren konnten zwei transponierbare Elemente identifiziert werden, IS1648 und Tn5417. Die Stabilitätsregion, welche zwischen den beiden transponierbaren Elementen positioniert ist, enthält zwei funktionelle Einheiten. Bei der ersten handelt es sich um das Protein MrpA (multimer resolution protein A), das ein neues Mitglied der l-Integrasen darstellt. Das Gen mrpA wurde in E. coli exprimiert und die Aktivität der Integrase untersucht. Die Erkennungssequenz mrpS der Integrase wurde über Mobility Shift-Experimente und durch Footprinting identifiziert. Sie besteht aus zwei 9 bp langen invers orientierten Sequenz-wiederholungen, die eine 18 bp große Kernregion flankieren. Zwei Integrase-Moleküle binden nicht-kooperativ in mrpS und induzieren dabei eine Beugung der DNA. Durch Expressionsstudien mit Hilfe einer Transkriptionsfusion mit xylE als Reportergen wurde eine Autoregulation durch MrpA nachgewiesen. In vivo Untersuchungen in E. coli zeigten die Fähigkeit von MrpA, in trans aus Plasmiden, die eine mrpS-Sequenz tragen, Multimere zu bilden und diese auch in Monomere aufzulösen. Liegen zwei mrpS-Sequenzen auf einem Plasmid vor, kommt es bei Zugabe von MrpA zur Deletion bzw. Inversion der DNA-Fragmente, die sich zwischen den cis-aktiven Erkennungssequenzen der Integrase befinden. Die zweite funktionelle Einheit der Stabilitätsregion bilden die Partitionsgene parA und parB, die zur Stabilität von SCP2* beitragen. Das Partitionssystem gehört zur Familie des Walker Ib-Typs. Das parA-Gen codiert eine ATPase. Das Gen wurde in E. coli exprimiert und die Magnesium-abhängige ATPase-Aktivität in Rohextrakt und gereinigtem Enzym untersucht. Das parB-Gen von SCP2* zeigt keine Verwandtschaft zu anderen parB-Genen und konnte in E. coli nur in sehr geringen Mengen exprimiert werden. Mit eGFP-Fusionen konnte die Verteilung von ParA und ParB in E. coli sichtbar gemacht werden. Expressionsstudien mit Hilfe von xylE-par-Fusionen in Streptomyces lividans deuten auf eine Regulation des par-Operons durch ParB hin. Der Beitrag, den die einzelnen Gene aus der Stabilitätsregion zur Stabilität des Plasmids SCP2* leisten, wurde untersucht, indem die Gene einzeln oder in Gruppen in Vektoren eingefügt wurden. Befinden sich alle drei Stabilitätsgene (mrpA, parA, parB) auf einem Plasmid, werden die Plasmide mit einer Wahrscheinlichkeit von 96 % in die Sporen segregiert. MrpA leistet dabei den wichtigsten Beitrag. Durch die Ermittlung der SCP2*-Sequenz konnten im Replikationsbereich von SCP2* zwei offene Leserahmen und eine nicht-codierende Region von 650 bp identifiziert werden, welche notwendig und ausreichend für die Replikation des Plasmids sind. Die entsprechenden Proteine RepI (161 Aminosäuren) und RepII (136 Aminosäuren) konnten in E. coli exprimiert werden. Die Interaktion von RepI mit dem nicht-codierenden DNA-Bereich aus der Replikationsregion von SCP2* wurde durch Mobility Shift-Experimente und Footprint-Untersuchungen gezeigt. Die Bindung erfolgt an drei Sequenzwiederholungen. Weiterhin können die Rep-Proteine in S. lividans ein Plasmid in trans komplementieren, welches nur den nicht-codierenden Bereich aus der Replikationsregion von SCP2* enthält und folglich alleine replikationsdefizient ist. Mit diesen Ergebnissen als Basis wurden verschiedene SCP2-Shuttle-Vektoren konstruiert, die in E. coli eine hohe Kopienzahl und in S. lividans wie auch das Ausgangsplasmid SCP2 eine niedrige Kopienzahl haben. Diese sollten besonders für die Klonierung großer Fragmente geeignet sein, unterscheiden sich aber durch die viel geringere Größe und damit bessere Handhabung von den bisher verwendeten SCP2-Vektoren.
Open Access
A systematic study of nonionic di‐ and multiborane catalysts for the oligomerization and polymerization of epoxides
(2024) Haug, Iris; Eberhardt, Marc; Krappe, Udo; Naumann, Stefan
Borane catalysis has emerged as a powerful technology in epoxide polymerization. Still, the structure‐activity correlations for these catalysts are not fully understood to date, especially regarding compounds with nonionic backbones. Thus, in this work, 13 different borane catalysts of this respective type are described and investigated for their epoxide oligomerization and polymerization performance, using propylene oxide (PO), 1‐butylene oxide (BO) and allyl glycidyl ether (AGE) as monomers. Structurally, special emphasis is put on catalysts with different linker lengths and linker flexibilities as well as the introduction of more than two borane functionalities. Importantly, this screening is conducted both under typical polymerization conditions as well as under the chain transfer agent (CTA)‐rich conditions relevant for large‐scale production. It is found that suitable preorganization of the borane groups, such as present in biphenyl derivatives, offers a simple route to high‐performing catalysts and quantitative monomer conversion of the investigated epoxides. Furthermore, it is demonstrated that a diborane‐catalyzed oligomerization can be kept active over weeks, whereby repeated addition of monomer batches (14 steps) constantly results in full conversion and well‐defined oligoethers, underlining the practical potential of this method. The absence of co‐initiating counter ions is suggested as an inherent advantage of nonionic catalysts.