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Open Access
Detektion und Charakterisierung von Zellwandproteinen in Candida albicans
(2008) Hiller, Ekkehard; Brunner, Herwig (Prof. Dr.)
Candida albicans ist ein weit verbreiteter human pathogener Organismus, der sowohl oberflächliche wie auch systemische Infektionen verursacht. Diese treten vor allem bei Personen mit geschwächtem Immunsystem auf. Bei der Infektion spielen die Zellwand und ihre Bestandteile eine besonders wichtige Rolle. Dieses komplexe Netzwerk aus Glucan, Chitin, Mannan und Proteinen stellt die Naht¬stelle der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen dar. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mehrere der in dieses Netzwerk eingebundenen Proteine ausschlaggebend für die Adhäsion und die Interaktion mit dem Wirt und seinem Immunsystem sind. Hinweise auf Änderungen im Zell¬wand-Proteom während des Übergangs vom Wachstum als Blastosporen hin zu Hyphen wurden zuerst im Microarray Experimenten gefunden, und konnten später in Untersuchungen bestätigt werden, die sich auf die Zellwandproteine konzentrierten. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Proben¬vorbereitung verglichen, um die kovalent an die Zellwand gebundenen Proteine oder deren Peptide durch massen¬spektro¬metrische Methoden zu identifizieren. Trypsin, Endo¬proteinase Glu-C und Bromcyan zur Freisetzung von Proteinfragmenten wurden allein oder in Kombination verwendet und miteinander verglichen. Zusätzlich untersucht wurden die Auswirkungen einer Vor¬behandlung der Zell¬wand durch eine β-1,3-Glucanase. Die Identifikation der Peptide erfolgte mittels zweier verschiedener Massenspektrometer. Insgesamt konnten 33 Proteine in der Wachstumsform der Blastosporen identifiziert werden, sechs davon mit vorhergesagtem GPI-Anker. Im Gegensatz dazu wiesen 14 der 18 identifizierten Proteine aus Hyphen-Zellen diese spezifische Ankersequenz auf, 12 davon sind in dieser Wachstumsform transkriptionell induziert. Zwischen den verwendeten Methoden wurde eine hohe Varianz in der Zahl identifizierter Proteine, bzw. der Zahl zu einem Protein gehörender Peptide, gefunden. Zusätzlich wurden die von C. albicans in synthetische Flüssigmedien sekretierten Proteine identifiziert. Unter den sowohl von Blastosporen wie auch Hyphen sekretierten Proteinen befand sich Sun41p. In einer früheren Arbeit wurde gezeigt, dass die Transkription dieses Proteins in Hyphen induziert wird. Die SUN Gen Familie, zu der es gehört, wurde in S. cerevisiae definiert und beinhaltet eine für Pilze spezifische Familie von Proteinen die eine hohe Übereinstimmung in ihrer C-terminalen Domäne aufweisen. Gene dieser Familie sind in unterschiedliche zelluläre Prozesse wie DNS-Replikation, Alterung, mitochondriale Biogenese und Cytokinese involviert. In C. albicans gehören zwei Gene, SUN41 und SIM1, dieser Familie an. Da Sun41p als potentieller Virulenz¬faktor Ziel einer gegen Pilze gerichteten Therapie darstellen kann, wurde seine Funktion durch die Konstruktion einer SUN41 Deletionsmutante untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass C. albicans Mutanten ohne SUN41 ähnliche Defekte aufweisen wie sie auch bei entsprechenden S. cerevisiae Mutanten gefunden wurden. Dies beinhaltet unter anderem Defekte bei der Cyto¬kinese. Zusätzlich zeigten die SUN41 Mutanten eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber der die Zellwand schädigende Substanz Kongorot, wohingegen bei der Anwesenheit von Calcofluor Weiß keine Veränderung beobachtbar war. Im Vergleich mit dem Wildtyp wies der SUN41 Deletions-Stamm Defekte bei der Bildung von Biofilmen auf, zeigte eine reduzierte Adhäsion auf einem epithelialen Gewebemodell und konnte unter den getesteten Bedingungen auf Festmedien keine Hyphen bilden. Die Ergebnisse deuten auf eine Funktion von Sun41p als Glycosidase hin, die an der Zellwand-Biogenese beteiligt ist und dadurch die Cytokinese, die Adhäsion am Wirtsgewebe, die Bildung von Biofilmen und die Virulenz beeinflusst. Dies weist auf eine wichtige Rolle von Sun41p bei der Interaktion des Pathogen mit dem Wirt hin.
Open Access
Inter-laboratory validation of an HPLC-MS/MS method for the detection of microbial transglutaminase in meat and meat products
(2022) Jira, Wolfgang; Behnke, Thomas; Brockmeyer, Jens; Frost, Kirstin; Hiller, Ekkehard; Möllers, Manfred; Niedzwiecka, Alicia; Pöpping, Bert; Uhlig, Steffen; Weidner, Markus; Wittke, Stefan; Becker, René
Microbial transglutaminase (TG) is an enzyme isolated on an industrial scale from Streptomyces mobaraensis. Technical TG, a formulated powder, is primarily used to restructure meat in the meat-processing industry, typically at a 1% concentration and is often referred to as “meat glue.” In the European Union, meat restructured with TG requires the indication “formed meat” on the label according to Regulation (EU) No 1169/2011. In order to detect food fraud like the undeclared TG usage in meat and meat products, a qualitative mass spectrometric method using specific tryptic marker peptides has been published in 2017. Here the successful inter-laboratory validation and first-time standardization of a proteomics method for food control is described, which was subsequently included into the Official Collection of Analysis Methods according to the German Food and Feed Code (§ 64 LFGB). Thirteen laboratories from governmental, academic, and private institutions participated in the study, whereas four laboratories did not meet the minimal quality criteria and therefore their results had to be excluded. Three different test materials containing between 0.2 and 2% technical TG as well as blank samples were produced and tested. The laboratories used triple-quadrupole mass spectrometers from several vendors as well as quadrupole time-of-flight instruments. The detection of TG was considered to be positive, if three mass transitions for the marker peptides VTPPAEPLDR (TG-1) and SPFYSALR (TG-2), each, showed a signal-to-noise ratio of at least 3. The level of detection LOD95% for the median laboratory with intermediate performance was 0.31%, the false-positive rate was 0% and the false-negative rate was 2.1%.