Browsing by Author "Jendrossek, Dieter (PD Dr.)"

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    Neuartige Poly(3-Hydroxybutyrat) Depolymerasen aus Paucimonas lemoignei und Rhodospirillum rubrum
    (2003) Handrick, René; Jendrossek, Dieter (PD Dr.)
    Aus Paucimonas lemoignei-Kulturüberstand wurde eine neuartige unter Kohlenstoffmangel während des späten exponentiellen Wachstums auf organischen Säuren oder parakristallinen dPHASCL {denaturierte Poly[(R)-3-Hydroxyalkanoate]; Monomeruntereinheiten C3-C5} gebildete PHASCL Depolymerase (PhaZ7; 36.2 kDa, stabil bis pH 12, 60°C) isoliert. Das Enzym hydrolysierte amorphe nPHASCL (zu 3-HA Pentamer) und ataktische P[(R,S)-3-HB]. PHAMCL (> C6), Polynukleotide, Proteasesubstrate, Poly(6-Hydroxyhexanoat), Lipide wurden nicht hydrolysiert. phaZ7 mit SacB-Signalsequenz wurde heterolog in Bacillus subtilis expremiert. Partielle Homologien zu Bacillus Lipasen und ortsgerichte Mutagenese präferieren S136, D242, H306 (H47G48 Oxyanion) als katalytische Triade. PhaZ7 entspricht dem „dPHB Depolymerase Inhibitor“ (MUKAI et al., 1992). Substratspezifität/kinetischen Studien wiesen auf eine Kooperativität der PHASCL Depolymerasen aus P. lemoignei hin. Intrazelluläre nPHASCL Depolymerase aus Rhodospirillum rubrum (PhaZ1Rr) wurde gereinigt und charakterisiert. Die nPHB-Hydrolyse in vitro erforderte zwei lösliche Komponenten: thermostabilen „Aktivator“ und thermolabile Depolymerase (MERRICK & DOUDOROFF, 1964). Vorinkubation von nPHB mit Aktivator oder Proteasen erhöhte die Hydrolyserate (> 6x). Der Aktivator war Protease-sensitiv, stabil in Alkanen, Ketonen, Alkoholen und schwach polaren Lösungsmitteln. PhaZ1Rr (35kDa, Topt.50°C, pHopt.9) hydrolysierte nPHB (3.1mmol cuts min-1 mg-1) unabhängig von Granula-Ursprung und Art der Aktivierung zu 3-HA-Mono-, Di- und Trimer, besaß jedoch keine Lipase-, Protease- oder Esteraseaktivität (lösliche Ester). phaZ1Rr wurde in E. coli heterolog expremiert. Die Aminosäuresequenz war homolog zu dPHASCL-Depolymerasen Typ 2. Linker- und Substratbindedomäne fehlten. Die Lipasebox (GIS19SG) entsprach PHAMCL Depolymerasen. Sequenzhomologien und Sekundärstrukturanalysen weisen auf S19, D115, H155 (H250G251 Oxyanion) als katalytische Triade hin.