Browsing by Author "Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)"

Now showing 1 - 11 of 11

Open Access
Das Abbauverhalten des PHB-Granulumkomplexes aus Ralstonia eutropha : Charakterisierung mit Hilfe neu entwickelter Methoden
(2009) Gebauer, Birgit; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Eine Reihe von Mikroorganismen ist in der Lage, Kohlenstoff zu speichern, wenn aus Mangel an anderen essentiellen Substraten kein Wachstum möglich ist. Dies geschieht intrazellulär über amorphe Polyester wie Poly(3-hydroxybutyrat), PHB, die in Form von Granula eingelagert werden. Ist die Nährstoffversorgung für Wachstum und Vermehrung wieder im Gleichgewicht, kann der Kohlenstoffspeicher mit Hilfe von intrazellulären Depolymerasen (PhaZ) abgebaut und genutzt werden. Für den Modellorganismus Ralstonia eutropha H16 wurden bisher sieben intrazelluläre Depolymerasen und zwei Oligomerhydrolasen postuliert. Nur zwei der Depolymerasen konnten jedoch auf der Oberfläche der Granula nachgewiesen werden: PhaZa1 und PhaZd. Zusammen mit den Granula-gebundenen Phasin-Proteinen (PhaP), der PHB-Synthase (PhaC) und anderen Proteinen bilden sie ein komplexes System, das man durchaus als Organell bezeichnen kann (Jendrossek 2009). Diese Arbeit charakterisiert erstmalig die Depolymerase-Aktivität des gesamten Granulumkomplexes, indem bekannte Techniken und neue Methoden kombiniert wurden.
Open Access
Biochemische und strukturbiologische Untersuchungen zur Substratbindung der extrazellulären PHB Depolymerase PhaZ7 aus Paucimonas lemoignei
(2015) Vogel, Siska; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
1. In dieser Arbeit wurden biochemische und strukturbiologische Untersuchungen an der extrazellulären PHB Depolymerase PhaZ7 aus Paucimonas lemoignei durchgeführt. Das Ziel ist die an der Substratbindung beteiligten Aminosäuren zu identifizieren. 2. Das PhaZ7 Protein wurde an dem C-terminalen Ende mit His6-Tag fusioniert, um die PhaZ7 Aufreinigung zu erleichtern. Dadurch konnte eine reproduzierbare Ausbeute von mindestens 3 mg PhaZ7chis6 Protein pro Liter Nährlösung erreicht werden. Die Reinheit des isolierten Proteins betrug über 99 %. Die Einführung des C-terminalen His6-Tags hatte keine signifikante Wirkung auf die Proteinexpression, Stabilität oder die spezifische nPHB Depolymerase Aktivität des PhaZ7chis6 Proteins. 3. Es wurde folgende PhaZ7chis6* Muteine konstruiert: Phe9Glu, Tyr66Glu, Tyr103Ala, Tyr103Glu, Tyr105Ala, Tyr105Phe, Tyr105Glu, Tyr124Glu, Tyr169Glu, Tyr172Ala, Tyr173Ser, Tyr176Glu, Tyr189Ala, Tyr189Glu, Tyr190Ala, Tyr190Glu, Phe198Glu, Tyr203Ser, Tyr204Ser, Trp207Glu, Phe251Glu, Trp252Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208. Nur die Aminosäurenaustausche an Tyr105, Tyr176, Tyr189, Tyr190, Trp207 und die Entfernung der Region Trp202-Val208 führten zu einer Veränderung in der Enzymkinetik im Vergleich zum Wildtyp PhaZ7chis6. 4. Das PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208 Mutein wurden mit einer Ausbeute von mindestens 7 mg Protein pro Mutein gereinigt. 5. Die in vitro nPHB Depolymerase Aktivitätstests mit gereinigtem PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208 Mutein zeigten eine Lag-Phase zu Beginn der Hydrolyse. Die spezifische Aktivität dieser Muteine mit Ausnahme des PhaZ7chis6* Trp207Glu Muteins lag unter 10 % der spezifischen Wildtyp Aktivität. Das PhaZ7chis6* Trp207Glu Mutein verfügte noch über 30 % der Wildtyp Aktivität. Die Lag-Phase am Anfang der Reaktion deutet auf eine Beeinträchtigung der Substratbindung hin. 6. Ein in vitro Bindungsassay für PhaZ7 an das natürliche Substrat (nPHB) wurde entwickelt. Für dieses Assay ist es zunächst notwendig, das PhaZ7 Protein aufgrund der sehr hohen nPHB Hydrolyseaktivität (6 x 106 U/mg) zu inaktivieren. Dies erfolgte durch die Mutation des Ser136 zu Alanin. 7. Für die PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208 Muteine wurde eine inaktive Variante durch zusätzliche Ser136Ala Mutation konstruiert. Alle inaktiven Muteine wurden gereinigt. Die Ergebnisse der Bindungstests wiesen auf eine stark reduzierte nPHB-Bindung bei den oben genannten inaktiven PhaZ7chis6* Varianten auf. Die nPHB-Bindung des inaktiven Trp207Glu ist stärker als bei den restlichen Muteinen aber signifikant schwächer im Vergleich zum inaktiven Wildtyp. 8. Zusammen zeigen die Ergebnisse der nPHB Deolymerase Aktivitätstests und der Bindungstests eine Beteiligung von Tyr105, Tyr176, Tyr189, Tyr190, Trp207 und der Region Trp202-Val208 an der nPHB-Bindung. 9. Die Struktur des PhaZ7chis6 Wildtyps und der PhaZ7chis6* Muteine (Tyr105Ala, Tyr105Glu, Tyr190Glu und DelTrp202-208) wurde bereits mit einer Auflösung von 1,6 – 2 Å aufgeklärt. Eine bedeutende strukturelle Veränderung in der PhaZ7chis6* Muteinstruktur im Vergleich zu der Wildtyp Struktur wurde nicht gefunden. 10. Die Aufklärung der Struktur von PhaZ7chis6* Ser136Ala, welche an dem 3-HB Trimer gebunden ist, zeigte, dass das Trimer in einer Furche umgeben von Tyr105, Ser168, Tyr176, Pro182, Gln187, Asn188, Tyr189, Tyr190 und Phe195 gebunden ist. Die Strukturanalyse zeigte Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Trimer und dem Stickstoffatom in der Tyr189 Hauptkette bzw. in der Asn188 Seitenkette. Zu erkennen sind ferner die hydrophoben Wechselwirkungen des Trimers mit Tyr105, Tyr176 und Tyr190. Demzufolge wurde die Beteiligung der Tyr105, Tyr176, Tyr189 und Tyr190 an der Polymer Bindung bestätigt. 11. Die Struktur der freien PhaZ7chis6* Ser136Ala unterschied sich von der an das Trimer gebundenen Struktur. Die Hauptunterschiede bilden die Regionen 281-294 und 248-251. Die Region 281-294 ist in dem 3HB-Trimer-PhaZ7chis6* Ser136Ala Komplex nicht gelöst und deutet auf eine Beweglichkeit in dieser Region hin. Dies gilt als einen Hinweis für eine Konformationsänderung des Proteins nach der Substratbindung und unterstutzt die Hypothese dieser Arbeit.
Open Access
Biochemische, biophysikalische und molekularbiologische Charakterisierung bakterieller poly(cis-1,4-isopren) Oxygenasen
(2016) Birke, Jakob; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Das Thema der Arbeit war die Charakterisierung von RoxA (Rubber oxygenase A) aus Xanthomonas sp. 35Y und Lcp (Latex clearing protein) aus Streptomyces sp. K30. Beide Enzyme initiieren den Abbau von poly(cis-1,4-isopren), indem das Polymer in kleinere Fragmente gespalten und den Produkten dabei Aldehyd- sowie Ketogruppen eingefügt werden. Bei RoxA wurde die Umgebung des N-terminalen Hämzentrums näher untersucht, dem vermuteten aktiven Zentrum, das im „as isolated“ Zustand an der distalen Seite ein O2-Molekül bindet. Anhand der dreidimensionalen Struktur wurden hier verschiedene Aminosäurereste ausgewählt und zielgerichtet mutiert. Tryptophan 291 (W291) liegt auf der proximalen Seite des N-terminalen Hämzentrums und interagiert vermutlich mit dem axialen Histidinliganden (H195). Gereinigtes RoxA-W291Y zeigte eine Aktivität von nur 5% gegenüber dem Wildtyp. Der Aktivitätsverlust und die festgestellten veränderten O2-Bindungseigenschaften lassen sich durch eine verringerte Stabilität oder eine veränderte Positionierung von H195 erklären. Die Aminosäurereste Phenylalanin 301 und 317 (F301 und F317) sind besonders nah und in auffälliger Orientierung zur distalen Seite der N-terminalen Hämgruppe lokalisiert. Eine Substitution der Reste durch andere Aminosäuren führte zu einem Aktivitätsverlust bei den nativ gereinigten Muteinen (von 80% Aktivitätsverlust bei RoxA-F301L bis > 99% bei RoxA-F317Y). Alle Muteine dieser beiden Positionen wiesen veränderte Eigenschaften im UVvis-Spektrum auf, besonders im Bereich der Q-Banden (500 nm - 600 nm), wo im Zustand „as isolated" eine schwächere Absorption als bei RoxA-Wt deutlich wurde. Bei einer Inkubation mit Pyridin, das zu einem Verdrängen des hämgebundenen Sauerstoffs in der Lage ist, zeigte sich bei diesen Muteinen (bis auf RoxA-F301Y) nahezu keine Auswirkung auf das Spektrum. Dies wurde besonders an dem nur schwach ausgeprägten Absorptionssignal bei 549 mm erkennbar, was sie von RoxA-Wt unterscheidet. Die genannten Eigenschaften lassen sich durch eine verminderte O2-Bindungsfähigkeit der Muteine im Vergleich zu RoxA-Wt erklären. In RoxA haben die Aminosäurereste F301 und F317 demnach eine besondere Rolle bei der Bindung und Stabilisierung von molekularem Sauerstoff. Diese Stabilisierung trägt dazu bei, dass RoxA den molekularen Sauerstoff im „as isolated“ Zustand über sehr lange Zeit binden kann, ohne oxidativ inaktiviert zu werden. Diese Besonderheit unterscheidet RoxA von anderen hämhaltigen Dioxygenasen wie der Tryptophan-2,3-Dioxygenase (TDO) und der Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO). Ungewöhnliche Merkmale wurden bei zwei untersuchten Muteinen festgestellt. Bei RoxA-F317Y ist das Sauerstoffatom des Tyrosinatrests axial an das N-terminale Eisenatom gekoppelt, wodurch die Sauerstoffbindestelle blockiert ist. Infolgedessen erklärt sich der vollständige Aktivitätsverlust dieses Muteins. RoxA-F301Y interagiert im Gegensatz zu RoxA-F317Y nicht direkt mit dem Eisenatom der Hämgruppe. Das gebundene O2-Molekül wird hier über Wasserstoffbrücken mit der Hydroxylgruppe des Tyrosins stabilisiert. Aus diesem Grund war ein Verdrängen von hämgebundenem O2 mit Imidazol bei diesem Mutein nicht möglich, was es von RoxA-Wt unterscheidet. Durch die heterologe Expression RoxA-orthologer Proteine aus drei verschiedenen Myxobakterien in Xanthomonas sp. 35Y ΔroxA gelang erstmals eine funktionelle Identifizierung von RoxA in anderen Gram-negativen Bakterien. Gezeigt werden konnte die Aktivität der nativ gereinigten RoxA-orthologen Proteine durch die Klärhofbildung entsprechender rekombinanter Xanthomonas sp. 35Y Stämme auf Latex overlay Agar und einen HPLC-basierten Nachweis des RoxA-Hauptspaltprodukts ODTD. Die UVvis-spektroskopischen Untersuchungen der RoxA-orthologen ergaben vergleichbare Ergebnisse zu RoxA aus Xanthomonas sp. 35Y. Charakteristisch war auch hier die teilweise scheinbare Reduktion nach Inkubation mit Pyridin, die durch das Verdrängen von hämgebundenem Sauerstoff zustande kommt. Im UVvis-Spektrum konnten nach Reduktion mit Dithionit die beiden Hämzentren über die split-α-Bande unterschieden werden, wie es auch bei RoxA aus Xanthomonas sp. 35Y der Fall ist. Ein Unterschied ergab sich bei der Auswirkung von β-Carotin auf die Aktivität, RoxA aus Xanthomonas sp. 35Y wurde hierdurch deutlich weniger inhibiert (55% Aktivität) als RoxA aus Corallococcus coralloides BO35 (10% Aktivität). Dadurch kann eine veränderte Substratspezifität der RoxA-orthologen Proteine im Vergleich zu RoxA aus Xanthomonas sp. 35Y angenommen werden. Die in der hier vorliegenden Arbeit untersuchten Aminosäurereste F301, F317 und W291 sind innerhalb der RoxA-orthologen konserviert und verdeutlichen die Wichtigkeit der Aminosäurereste für diese Enzyme. Das aus dem Gram-positiven Bakterium Streptomyces sp. K30 stammende Lcp konnte in Xanthomonas sp. 35Y ΔroxA funktionell exprimiert werden, was auf Latex overlay Agar durch den Nachweis der Spaltprodukte mit Schiff's-Reagenz sichtbar gemacht wurde. Eine neu etablierte Zwei-Stufen Reinigung von nativem Lcp erlaubte eine erste Charakterisierung des Enzyms. Das pH-Optimum lag zwischen 7 und 8 in 100 mM Kaliumphosphatpuffer. Detergenzien inhibierten die Aktivität vollständig, Imidazol und Dithiothreitol teilweise. Bis auf Diethyldithiocarbamat hatten andere Chelatbildner keinen inhibitorischen Effekt auf die Aktivität von Lcp. Bei 37°C zeigte sich eine deutlich höhere temperaturabhängige Inaktivierung für Lcp als für RoxA. Die Ausbeute war mit 1,5 mg Lcp pro 12 l Kultur sehr gering, für weitere Untersuchungen wurde daher Lcp N-terminal mit einem Strep-Tag ausgestattet und in E. coli heterolog exprimiert. Die Ausbeute steigerte sich so auf das 40-fache (5 mg/l). Die spezifische Aktivität von Lcp wurde auf Basis des verbrauchten Sauerstoffs im Reaktionsansatz ermittelt (23°C: 1,5 U/mg; 37°C: 4,6 U/mg). Über einen spektroskopischen Test und auch mittels MALDI-TOF Analyse (Matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight) ließ sich Lcp den b-Typ Cytochromen zuordnen. Spektroskopische Untersuchungen mit Imidazol und Kohlenstoffmonoxid offenbarten eine oxidierte und damit sauerstofffreie Hämgruppe (Fe3+), was im Gegensatz zur Hämgruppe des aktiven Zentrums von RoxA steht (Fe2+--O2).
Open Access
Biologische Untersuchungen zum „lower acyclic terpene utilisation (atu) pathway“ in Pseudomonas aeruginosa und chemische Synthese wichtiger Intermediate dieses Stoffwechselweges
(2012) Randel, Nadine; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Der Abbau von Citronellol und verwandten azyklischen Terpenoiden ist aufgrund einer Methylgruppe in beta-Position schwierig und nicht weit verbreitet. Die Organismen P. aeruginosa und P. citronellolis umgehen die Blockierung der beta-Oxidation durch Carboxylierung dieser Methylgruppe auf Stufe des CoenzymA-Esters 19 (Geranyl-CoA). Durch Wasseranlagerung an die Doppelbindung wird die Voraussetzung für die Abspaltung der Acetat-Funktionalität geschaffen, wobei die resultierende Verbindung 23 (7-Methyl-3-oxo-6-octenoyl-CoA) folgend weiter über beta-Oxidation abgebaut werden kann. •In Rohextrakten von Citronellsäure (Cs)-gewachsenen P. aeruginosa PAO1 Zellen wurde eine spezifische Geranyl-CoA Carboxylase (GCase) Aktivität von 11 ± 6 mU/mg und eine spezifische Methylcrotonyl-CoA Carboxylase (MCase) Aktivität von 47 ± 11 mU/mg bestimmt. Rohextrakte von Isovaleriansäure (Iso)-gewachsenen Zellen enthielten 54 ± 22 mU/mg MCase Aktivität. •Eine über Avidin-Chromatographie gereinigte Präparation an Biotin-Carboxylasen wies MCase Aktivität in Höhe von 4600 ± 966 mU/mg (Iso-Zellen) bzw. von 1900 ± 1200 mU/mg (Cs-Zellen) auf. GCase Aktivität konnte nicht nachgewiesen werden. •Die Untereinheiten der MCase und GCase wurden rekombinant in E. coli synthetisiert und partiell gereinigt. Eine Bestimmung der Aktivität mit den selbsthergestellten CoA-Substraten konnte aber nur mit MCoA für die MCase erfolgen (2700 ± 126 mU/mg). Mit der rekombinanten GCase und GCoA 19 bzw. MCoA 29 konnte dagegen keine Aktivität bestimmt werden. •Neben den Carboxylasen wurden auch AtuD, AtuE und AtuA rekombinant exprimiert und als His-Tag Fusionsproteine aus E. coli Rohextrakten gereinigt. •Für AtuD konnte Citronellyl-CoA Dehydrogenase Aktivität sowohl über einen optischen Enzymassay (464 ± 9,9 mU/mg) als auch über den Nachweis des Reaktionsproduktes mittels HPLC-(ESI)-MS gezeigt werden. Eine Isolierung des so bereitgestellten cis-Geranyl-CoAs 19a aus dem Reaktionsansatz war jedoch nicht möglich. Auch eine Kopplung des Assays mit dem Carboxylase Assay und somit ein möglicher direkter Umsatz des gebildeten cis-GCoAs 19a über die Geranyl-CoA Carboxylase war nicht erfolgreich. •Die gereinigten rekombinanten Proteine AtuE (IHG-CoA Hydratase) und AtuA (mögliche HHG-CoA Lyase) wurden in erste Kristallisationsversuche eingesetzt. Für AtuE konnte kürzlich die Struktur mit 2,3 Å Auflösung gelöst werden. Der geplanten biochemischen Analyse beider Enzyme stand die Nichtverfügbarkeit der entsprechenden Substrate Isohexenyl-glutaconyl-CoA (IHG-CoA, 20) und 3-Hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21) entgegen. Der Versuch das Substrat der Hydratase enzymatisch über die Reaktion der vorangestellten GCase zu generieren scheiterte. Im Verlauf der chemischen Arbeiten gelang es allerdings eine Vorstufe des AtuE-Substrates 94 darzustellen. Der notwendige CoA-Ester 20 wurde synthetisiert. Eine Aktivität von nativem und rekombinantem AtuE als Hydratase konnte allerdings noch nicht gezeigt werden. Eine Funktion von AtuA als vermutliche HHG-CoA Lyase konnte in dieser Arbeit aufgrund des fehlenden Substrates 21 nicht untersucht werden. •Eine Trennung des cis/trans Isomerengemisches der Geranylsäure 8 war erst nach Überführung dieser in die jeweiligen Methylester 115a bzw. 115b möglich. Beide Methylester können nun als Referenzen für folgende Metabolit-Analysen dienen. Eine Verseifungsreaktion lieferte die isomerenreinen Säuren (8a, 8b) und nach der CoA-Ester Synthese auch cis- und trans-Geranyl-CoA (19a, 19b). •Unter Verwendung des Geranylsäuremethylesters 115 konnte erstmals eine Vorstufe des Hydratase-Substrates 125 in hoher Ausbeute dargestellt werden. Eine Trennung der beiden Doppelbindungsisomere (125a, 125b) gelang über semi-präparative HPLC. Diese Methylester stehen nun ebenfalls als Referenzverbindungen zur Verfügung. Durch Verseifung konnte die racemische Dicarbonsäure 94 und nach Synthese des CoA-Esters erstmalig auch das racemische Hydratase-Substrat 20 erhalten werden. Eine mögliche stereospezifische Hydroxylierung durch das Enzym Isohexenyl-glutaconyl-CoA Hydratase (AtuE) konnte nicht untersucht werden, da die hier dargestellten Isomere der Vorstufe (125a, 125b) nicht in die CoA-Ester Synthese eingesetzt werden konnten. •Versuche eine Vorstufe des Hydratase-Produktes/Lyase-Substrates darzustellen, waren nicht erfolgreich, jedoch konnten Daten erhalten werden, welche auf eine Instabilität der Verbindung 104 als eine Vorstufe des HHG-CoAs 21 hindeuten. Dies könnte bedeuten, dass auch das Substrat 21 der Lyase selbst nicht stabil ist und somit in vivo nur als kurzlebiges Intermediat vorliegt. Das 3-Hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21) ist für weitere Untersuchungen somit bislang nicht verfügbar. Im Gegensatz dazu gelang es erstmalig eine Vorstufe des Lyase-Produktes darzustellen. Dieser Methylester 133 steht nun ebenfalls als Referenzverbindung für anschließende Untersuchungen zur Verfügung.
Open Access
Der Citronellolstoffwechsel in Pseudomonaden - Funktionelle Zuordnung beteiligter Gene und deren Produkte
(2008) Förster-Fromme, Karin; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Citronellol und Geraniol sind in der Natur als Duftstoffe weit verbreitete azyklische Terpenoide, die aufgrund ihrer β-ständigen Methylgruppe nicht über β-Oxidation abgebaut werden können. In jüngster Zeit konnten zwei in den Citronellolabbau involvierte Gencluster in P. aeruginosa PAO1 identifiziert werden, das atu (acyclic terpene utilisation)- und das liu (leucine/isovalerate utilisation)-Gencluster (FÖRSTER-FROMME ET AL., 2006, HÖSCHLE ET AL., 2005). Bisher konnten nur die Gene der in den Citronellolstoffwechsel involvierten Carboxylasen funktionell identifiziert werden (HÖSCHLE ET AL., 2005). In dieser Arbeit wurden weitere Gene der Cluster funktionell zugeordnet. - In P. citronellolis wurde ein Gencluster (atuABCDEFGH) identifiziert und sequenziert, dessen Gene sehr hohe Identitäten zu den atu-Genen von P. aeruginosa PAO1 aufwiesen. Dieses Gencluster wurde als atu-Gencluster von P. citronellolis annotiert. Eine Insertionmutante in atuA zeigte, daß dieses Gen essentiell für den Citronellolabbau ist. - In P. citronellolis konnte anhand zweier Transposonmutanten in mqoB gezeigt werden, daß die Malat-Quinon-Oxidoreduktase (MqoB) eine essentielle Rolle beim Abbau von Terpenoiden spielt, da die Endprodukte des Citronellolabbaus in den Glyoxylatstoffwechsel eingehen und die Malat-Quinon-Oxidoreduktase ein essentielles Enzym dieses Stoffwechselweges ist. - In P. aeruginosa PAO1 konnte die Funktion der Citronellyl-CoA-Dehydrogenase AtuD zugeordnet werden. AtuD wurde exprimiert und gereinigt und eine spezifische Aktivität von 850 ± 37 mU/mg für den Umsatz von Citronellyl-CoA ermittelt. Der KM-Wert für Citronellyl-CoA beträgt 1,6 ± 0,3 µM. Das Reaktionsprodukt Geranyl-CoA wurde mit HPLC und Massenspektrometrie nachgewiesen. AtuD ist hochspezifisch für Citronellyl-CoA, da Isovaleryl-CoA oder Octanoyl-CoA nicht umsetzt werden. Durch 2D-Gelanalysen wurde eine weitere Acyl-CoA-Dehydrogenase als spezifisch beim Wachstum auf Terpenoiden erkannt und als PA1535-Genprodukt identifiziert. Das PA1535-Genprodukt wurde heterolog in E. coli exprimiert, gereinigt und die Substratspezifität bestimmt. Das Enzym setzte Citronellyl-CoA mit 2450 ± 26 mU/mg (KM-Wert 18 ± 1,1 µM) und Octanoyl-CoA mit 610 ± 10 mU/mg (KM-Wert 130 ± 9,8 µM) um. Isovaleryl-CoA stellt kein geeignetes Substrat dar. - In P. aeruginosa PAO1 wurde die Funktion der Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase LiuA zugeordnet. Gereinigtes LiuA setzte Isovaleryl-CoA mit 1620 ± 55 mU/mg (KM-Wert 2,3 ± 0,4 µM) um. Langkettige CoA-Thioester wie Citronellyl-CoA oder Octanoyl-CoA wurden nicht umgesetzt. - In P. aeruginosa PAO1 wurde das stromaufwärts des atu-Genclusters liegende Gen (PA2885) durch Insertionsmutangenese als Repressor des atu-Genclusters identifiziert (atuR). AtuR gehört zur TetR-Familie. In dem intergenischen Bereich zwischen atuR und atuA (280 bp) wurde eine Region mit Ähnlichkeit zu σ-70 Promotoren sowie partiell überlappend zwei perfekte inverted repeats gefunden. Heterolog exprimiertes und gereinigtes AtuRHis6 war in der Lage, in Gelshift-Experimenten spezifisch an den intergenischen Bereich zu binden. Für eine vollständige Bindung waren beide inverted repeats, nicht aber die -10- und die -35-Region notwendig. Citronellol, Geraniol, Citronellal, Geranial, Citronellsäure und Geranylsäure, nicht aber Leucin, Isovaleriansäure, 3-Methylcrotonsäure, Phytol und Eukalyptol verhinderten die Bindung von AtuR und stellen somit offenbar Effektoren von AtuR dar. - Mithilfe von Proteomanalysen wurde gezeigt, daß sechs von acht Atu-Proteinen und vier von fünf Liu-Proteinen spezifisch beim Wachstum auf azyklischen Terpenen, bzw. Isovalerat gebildet werden. Des weiteren wurden 16 weitere Proteine identifiziert, die vermutlich ebenfalls am Citronellolstoffwechsel beteiligt sind. - Bei P. aeruginosa POA1 wurden alle Gene des atu-Genclusters durch Insertion von pKnockout-G (WINDGASSEN ET AL., 2000) inaktiviert. Es wurde gezeigt, daß fünf der atu-Gene (atuA, atuB, atuC, atuD, atuF) essentiell für den Citronellolabbau waren. Insertionsmutanten in atuE, atuG und atuH zeigten keinen Phänotyp.
Open Access
Funktionale und strukturelle Charakterisierung von Polyphosphat und Polyphosphat-assoziierten Proteinen im ß-Proteobakterium Ralstonia eutropha H16
(2022) Rosigkeit, Hanna; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Open Access
Identifizierung neuer Proteine des Polyphosphat Granulumkomplexes von Ralstonia eutropha H16
(2017) Tumlirsch, Tony; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Open Access
Identifizierung und Funktionsanalyse neuartiger Proteine des PHB-Granulumkomplexes von Ralstonia eutropha H16
(2013) Pfeiffer, Daniel; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Poly(3-hydroxybuttersäure) (PHB) spielt eine wichtige Rolle als Kohlenstoff- und Energiespeicher in zahlreichen Mikroorgansimen. Intrazellulär gebildetes PHB liegt hierbei in Form von so genannten nativen PHB-Granula vor. An der Oberfläche der PHB-Granula sind unter anderem Proteine gebunden, welche für deren Synthese (PHB-Synthase, PhaC) oder Abbau (PHB-Depolymerase, PhaZ) verantwortlich sind oder das Oberfläche/Volumenverhältnis der Granula regulieren (Phasine, PhaP). Vorangegangene Arbeiten mit Ralstonia eutropha - dem Modellorganismus der PHB-Speicherung - zeigten, dass PHB-Granula in der frühen Phase ihrer Bildung nicht zufällig verteilt in der Zelle vorliegen, sondern gehäuft an den Zellpolen oder der inneren Seite der Cytoplasmamembran lokalisiert sind. Dies ließ eine spezifische Interaktion zwischen PHB-Granula-assoziierten Proteinen mit unbekannten Zielstrukturen in der Zellperipherie vermuten. Diese Annahme wurde durch die in der Literatur beschriebenen cytoskelettartigen Strukturen auf der Oberfläche nativer PHB-Granula unterstützt. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Proteine, welche spezifisch mit der PHB-Synthase oder anderen Oberflächenproteinen der PHB-Granula (z.B. Phasinen) interagieren, durch einen bakteriellen Two-Hybrid Assay identifiziert und anschließend auf ihre Beteiligung an der PHB-Granulabildung überprüft. Zur Identifizierung neuartiger Proteine des PHB-Granulumkomplexes wurden zudem weitere Methoden eingesetzt. PHB-Granula-assoziierte Proteine wurden ferner über eine Proteomanalyse isolierter PHB-Granula sowie eine Motivsuche nach Konsensussequenzen von Phasinen identifiziert. Im Zuge dieser Experimente konnten die vier bisher nicht beschriebene Proteine PhaP5 (H16_B1934), PhaP6 (H16_B1988), PhaP7 (H16_B2326) und PhaM (H16_A0141) identifiziert werden. Für diese Proteine konnte gezeigt werden, dass sie Phasin-ähnliche Eigenschaften aufweisen und mit den PHB-Granula assoziiert vorliegen. Insbesondere für PhaM und PhaP5 wurde nachgewiesen, dass diese Anzahl, Oberfläche/Volumen-Verhältnis und Lokalisierung der PHB-Granula regulieren können. PhaM war in der Lage mit dem Schlüsselenzym der PHB-Bildung der PHB-Synthase (PhaC1) zu wechselwirken. Weitere Protein-Protein-Interaktionen konnten zwischen PhaM und PhaP5 sowie zwischen PhaP5 und verschiedenen anderen Phasinen, dem Regulator der Phasin-Expression (PhaR) sowie der PHB-Depolymerase PhaZa1 nachgewiesen werden. Eine Überexpression von PhaM führte zu einer stark erhöhten Anzahl kleiner PHB-Granula, welche nahezu ausschließlich mit dem Nukleoid assoziiert waren. Bei Überexpression von PhaP5 waren die PHB-Granula hingegen überwiegend an den Zellpolen lokalisiert und ein Kontakt zum Nukleoid war nicht mehr nachweisbar. Zellen einer phaM-Deletionsmutante waren zudem in einer gleichmäßigen Aufteilung der Granula auf die Tochterzellen gestört und bildeten meist nur ein sehr großes PHB-Granulum. PhaM konnte aufgrund charakteristischer Alanine, Proline und Lysine (AAKP-Motive) im C-terminalen Bereich seiner Aminosäuresequenz den Histon H1-ähnlichen Proteinen zugeordnet werden. PhaM war in der Lage sowohl in vitro als auch in vivo unspezifisch an DNA (Nukleoid) zu binden. Aufgrund dieser Eigenschaften kann PhaM PHB-Granula physisch mit dem Nukleoid verknüpfen. Hierdurch wird gewährleistet, dass diese im Zuge der Chromosomensegregation und Zellteilung gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden. Anhand dieser neuen Erkenntnisse wurde ein Modell zur Verteilung der PHB-Granula während der Zellteilung entwickelt. In weiteren Experimenten wurde die Lokalisierung der PHB-Synthase untersucht und so neue Erkenntnisse zum Entstehungsort der PHB-Granula gewonnen. Dabei konnte gezeigt werden, dass PHB-Granula vermutlich nicht an der Zellmembran gebildet werden („Budding-Modell“). Die PHB-Synthase liegt hingegen ebenfalls über ihre Wechselwirkung mit PhaM an das Nukleoid gebunden vor. Das Nukleoid stellt damit den Bildungsort sowie Verankerungspunkt der PHB-Granula in der Zelle dar.
Open Access
Mikrobielle Biodegradation von Poly(cis-1,4-isopren) : Charakterisierung bakterieller Rubber Oxygenasen
(2020) Röther, Wolf; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Die vorliegende Arbeit untersucht den mikrobiellen Kautschukabbau. Die Rubber Oxygenase A (RoxA) wird von Gram negativen Bakterien sekretiert, wohingegen Gram positive Bakterien das Latex Clearing Protein (LCP) nutzen. Durch Vorarbeiten der AG Jendrossek war es möglich, lcpK30 aus Streptomyces sp. K30 rekombinant in E. coli zu exprimieren und das Genprodukt mittels Strep tag per Affinitätschromatografie aufzureinigen. In Zusammenarbeit mit IBA Lifesciences wurden verschiedene Strep Tactin Säulen eingesetzt und verglichen, die gewonnenen Erkenntnisse ermöglichten eine effizientere Aufreinigung von Lcp. Um spezifische Enzymaktivitäten zu vergleichen, wurde ein Aktivitätstest beschrieben, bei dem der Sauerstoffverbrauch während der Enzymreaktion bestimmt wird. Die generierten Oligo isoprenoid Spaltprodukte wurden per HPLC analysiert. Beide Methoden wurden in einem Methodenprotokoll beschrieben. In Zusammenarbeit mit Sirimaporn Watcharakul (Prince of Songkla University, Thailand) wurde ein neues kautschukabbauendes Bakterium aus dem Abwasser einer Kautschukfabrik in Thailand isoliert und als Rhodococcus rhodochrous RPK1 beschrieben. Das für die Latexspaltung verantwortliche Gen wurde als homologes LCP identifiziert und lcpRr konnte erfolgreich rekombinant in E. coli exprimiert werden. Die Aufreinigung des Genproduktes erfolgte per Affinitätschromatografie mittels Strep tag und ermöglichte die biochemische Charakterisierung von LcpRr. Durch eine bioinformatische Analyse wurden in einem Multisequenzalignment hochkonservierte Aminosäurereste in Lcps identifiziert. Drei dieser Reste sind in einer Domäne unbekannter Funktion (DUF2236) lokalisiert. Mittels Quikchange PCR wurden in lcpK30 die entsprechenden Codons jeweils einzeln gegen Alanin Codons ausgetauscht und die generierten Muteine aufgereinigt, um die mögliche Funktion der jeweiligen Reste in Lcp K30 zu untersuchen. R164A und T168A enthielten jeweils eine Hämgruppe, jedoch zeigten sie eine signifikant reduzierte Aktivität bei der oxidativen Spaltung von Polyisopren. Es konnte gezeigt werden, dass H198 einen axialen Liganden des Häm Eisen Ions darstellt. Die Reste R195 und R202 sind für die Struktur von LcpK30 essentiell, worauf anhand der Instabilität der entsprechenden Alanin Muteine geschlossen wurde. Diese Ergebnisse wurden nach der erfolgreichen Aufklärung der Struktur von LcpK30 durch Röntgenkristallografie bestätigt, welche in Kooperation mit Lorena Ilcu (AG Einsle, Albert Ludwigs Universität Freiburg) durchgeführt wurde. Das Enzym konnte als 3/3 Globin identifiziert werden. Der Globin Kern enthält eine b typ Hämgruppe und zeigt eine Ähnlichkeit zur Struktur von Myoglobin, weist jedoch eine zusätzliche L Helix auf und wird von weiteren C und N terminalen Helices umschlossen. Durch weitere Experimente gelang es, zwei mögliche Reaktionsmechanismen der oxidativen Polyisopren Spaltungsreaktion zu postulieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass das Häm Eisen Ion von LcpK30 sowohl pentakoordiniert, als auch hexakoordiniert vorliegen kann, was durch eine Verdrängung des zweiten axialen Häm Liganden K167 durch Imidazol in einer weiteren aufgeklärten Kristallstruktur gezeigt wurde. Die enzymatische Synthese von Oligo isoprenoiden im 100 mg Maßstab wurde durch eine Vergrößerung des Reaktionsansatzes auf 1 Liter Latexmilch erreicht und ermöglichte es, per FPLC eine Auftrennung der Mischung zu erzielen und reine Oligo isoprenoide bereitzustellen. Im mittlerweile komplett sequenzierten Genom von Xanthomonas sp.35Y wurde ein zu roxA homologes Gen identifiziert. Es gelang, dieses rekombinant zu exprimieren und das entsprechende Protein chromatografisch aufzureinigen. Dessen biochemische Charakterisierung zeigte Ähnlichkeiten zu RoxA wie eine vergleichbare Molekülmasse, sowie zwei Häm Bindemotive. Bei der Inkubation mit Latexmilch wurde der Verbrauch von Sauerstoff beobachtet, jedoch wurde per HPLC nicht das C15 Oligo isoprenoid 12 oxo 4,8 dimethyl trideca 4,8 dien 1 al (ODTD) als Hauptprodukt identifiziert, sondern die bereits bei Lcp beobachtete Mischung höherer Oligo isoprenoide. Daher wurde das Enzym RoxB genannt. Des Weiteren wurde ein synergistischer Effekt der Enzymaktivität von RoxB auf RoxA beschrieben. Dieser Effekt wurde auch für Rhizobacter gummiphilus bestätigt, indem beide Rubber Oxygenasen dieses Stammes aufgereinigt und charakterisiert wurden. Wachstumsversuche mit verschiedenen Bakterienstämmen wurden durchgeführt und es gelang erstmals, eine Wachstumskurve von Xanthomonas sp.35Y beim Wachstum in Flüssigkultur mit Latex als alleiniger Kohlenstoffquelle zu bestimmen. Die so gewonnenen Zellen wurden zur Proteomanalyse eingesetzt und zahlreiche Proteine des Metabolismus konnten nachgewiesen werden.
Open Access
Spektroskopische Charakterisierung der Rubber Oxygenase RoxA aus Xanthomonas sp. 35Y
(2012) Schmitt, Georg; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
Thema dieser Arbeit ist die Charakterisierung der "Rubber Oxygenase A" (RoxA), einer extrazellulären Di-Häm-Dioxygenase aus dem Gram-negativen Bakterium Xanthomonas sp. 35Y. RoxA katalysiert die oxidative Spaltung von Naturkautschuk (Poly(cis-1,4-isopren)) in Produkte mit Aldehyd- und Keto-Enden. Es wurde eine Charakterisierung des Enzyms durch UV-Vis- und EPR (Electron Paramagnetic Resonance)-Spektroskopie durchgeführt. Das EPR-Spektrum von RoxA "as isolated" weist konstante low-spin-Signale der His-His-koordinierten C-terminalen Hämgruppe und variable high- und low-spin-Signale der N-terminalen Hämgruppe mit nur einem His-Liganden auf. Ferner wurde erstmals das CD (Circular Dichroism)-Spektrum von RoxA beschrieben. Im Rahmen einer Inhibitor-Studie wurde eine Hemmung der RoxA-katalysierten Spaltungsreaktion durch Reduktions- und Oxidationsmittel, substratähnliche Substanzen und typische Hämliganden wie z. B. Imidazol festgestellt. Insgesamt erlaubten diese Untersuchungen auch eine kritische Einschätzung des Aktivitätstest-Verfahrens. Es wurde eine zweistufige chromatographische Reinigung von rekombinant homolog exprimiertem RoxA etabliert. Anhand unterschiedlicher {alpha}-Banden bei 549 nm bzw. 553 nm sind die Hämzentren im reduzierten Zustand zu unterscheiden. Übereinstimmend mit einer sukzessiven, bald aufeinander folgenden Reduktion der Hämgruppen, belegten Redoxtitrationen kaum unterscheidbare Häm-Redoxpotentiale bei –65 mV und etwa –145 mV. Die räumliche Struktur von RoxA, die in Kooperation mit der AG Einsle (Freiburg) in einer Auflösung von 1,8 Å erhalten wurde, zeigt das C-terminale Häm His-His-koordiniert, das N-terminale nur von einem His-Rest und einem "O"-Liganden an sechster Position. Auf dieser Grundlage konnte die spektroskopische Untersuchung das etwas höhere Redoxpotential und die {alpha}-Bande bei 549 nm dem N-terminalen Häm zuordnen und zeigen, dass dieses bereits in RoxA "as isolated" für die Bindung externer Hämliganden zugänglich ist. EPR-Spektren weisen auf die Lokalisierung von Poly(cis-1,4-isopren) in der nahen Umgebung, nicht aber direkt am Häm-Fe des gleichen Hämzentrums hin, und veranschaulichen eine erschwerte Hämliganden-Bindung bei Anwesenheit von Latex. Die RoxA-Struktur zeigt eine Ähnlichkeit zu bakteriellen Cytochrom c Peroxidasen (CCPs) und MauG-Proteinen in der Anordnung beider Hämgruppen, sowie einiger konservierter Aminosäuren in deren Umgebung. Dennoch weist die unpolare Umgebung des katalytischen Zentrums in RoxA einen klaren Unterschied zu diesen Enzymen auf. Aufgrund der fehlenden Peroxidase-Aktivität und Inhibierung durch H2O2, sowie beträchtlicher Unterschiede der Häm-Redoxpotentiale zu CCPs, widerlegen die Ergebnisse eindeutig, dass RoxA eine Funktion als Peroxidase erfüllt. Wichtige Erkenntnisse zu den Redox- und Spinzuständen der beiden Hämzentren in RoxA lieferten Versuchsansätze nach Reduktion und anschließender Reoxidation durch Luftsauerstoff im Vergleich zu anderen Oxidationsmitteln. Die Untersuchung des in Abwesenheit von Kautschuklatex exprimierten rekombinanten RoxA erlaubte Aussagen zum Grundzustand des Enzyms vor dem Kontakt mit dem Substrat. So unterstützen EPR-Spektren einen diamagnetischen, EPR-unsichtbaren Zustand des N-terminalen Hämzentrums in RoxA "as isolated". Damit zusammenhängend, entsprachen in Gegenwart von Oxidationsmitteln eintretende Veränderungen im optischen Spektrum solchen, die nach Entfernung von Sauerstoff eintraten. Die Annahme einer stabilen Fe(II)–O2<–>Fe(III)–O2•– -Koordination in RoxA "as isolated" bietet eine gemeinsame Erklärung für diese Phänomene. Diese Ergebnisse erlauben die Erstellung eines Rahmens für den katalytischen Mechanismus der Kautschukspaltung durch RoxA: Als Startpunkt der Spaltungsreaktion wird ein oxygenierter Grundzustand angenommen, dessen Stabilität darüber hinaus für ein c-Typ-Cytochrom sehr ungewöhnlich ist und an ein O2-Bindeprotein erinnert. Zudem verweisen die Ergebnisse auf den Ablauf der Kautschukspaltung allein am N-terminalen Hämzentrum, das eine Funktion zur Bindung und Aktivierung von O2 erfüllt. Für eine Beteiligung der C-terminalen Hämgruppe gibt es keine Hinweise. Auch zeigt die Struktur von reduziertem RoxA keine Konformationsänderung an. Das Kautschukpolymer könnte durch einen hydrophoben Kanal zum katalytischen Hämzentrum gelangen. RoxA ist bislang das einzige c-Typ-Cytochrom, von dem eine Dioxygenase-Aktivität beschrieben ist. In jüngerer Zeit wurden jedoch zum RoxA-Protein ähnliche Genprodukte in den Gram-negativen Haliangium ochraceum (Hoch_1661, Hoch_1441) und Myxococcus fulvus (LILAB_11505), sowie Ähnlichkeiten in der jeweiligen genomischen Umgebung gefunden. Deren Entdeckung regt die Diskussion über eine Entwicklung unterschiedlicher Kautschuk spaltender Enzyme in Gram-positiven (Lcp) und Gram-negativen Bakterien (RoxA), sowie die Existenz weiterer RoxA-Homologen in Xanthomonas sp. an.
Open Access
Stringent response and phosphorylations of PHB synthase and PHB depolymerase influence the PHB content of Ralstonia eutropha H16
(2018) Jüngert, Janina Rachel; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)
A physiological connection between polyhydroxybutyrate (PHB) metabolism and the formation of polyphosphate (polyP) granules is known in form of the "enhanced biological phosphate removal process" (EBPR) and is used to expurgate phosphate from waste-water. Unfortunately, EBPR bacteria such as candidatus Accumulibacter phosphatis cannot be cultivated in pure cultures. In this work the question of a potential link between PHB and polyP metabolism in Ralstonia eutropha H16, an easy to cultivate β-proteobacterium that is well-known for its ability to synthesise PHB and polyP and that is taxonomically related to candidatus Accumulibacter phosphatis, was addressed. R. eutropha was used to simulate the EBPR process as a model organism and the adaptation to EBPR conditions was monitored. It could be shown that despite its similarities to c. A. phosphatis, R. eutropha is not an appropriate model organism for the EBPR process due to its inability to adapt to anaerobic conditions and to metabolize carbon sources during oxygen depletion. Nevertheless R. eutropha remains a model organism for the accumulation of the intracellular carbon and energy storage compound PHB. PHB helps to survive under starvation and stress conditions. Over the past three decades different laboratories demonstrated the PHB synthesising enzyme PhaC1 and the PHB degrading enzyme PhaZa1 are constitutively expressed. Consequently a different regulation for the activity of PhaC1 and PhaZa1 is necessary to avoid a futile cycle of simultaneous PHB synthesis and PHB degradation. Previous reports suggested a connection between players of stringent response and the regulation of the PHB metabolism but alarmones were never quantified. In this work a method to extract and quantify (p)ppGpp from R. eutropha was established. This enabled to study the relationship between (p)ppGpp concentrations and PHB accumulation in the wild type and in different mutants of genes involved in stringent response. Single-, double-, and triple-gene deletion strains of R. eutropha in (p)ppGpp synthase/hydrolase (spoT1), (p)ppGpp synthase (spoT2) and polyhydroxybutyrate (PHB) depolymerase (phaZa1 or phaZa3) genes were constructed. Absence of ppGpp in a ΔspoT1 ΔspoT2 double deletion strain correlated with elongation of the cells and enhanced degradation of PHB due to PhaZa1-mediated depolymerisation of PHB. In line, the overproduction of ppGpp by treatment with amino acid analogues or over-expression of SpoT2 in absence of SpoT1 correlated with reduced growth and significant overproduction of PHB. Data on a previously constructed ΔspoT2 strain (Brigham et al., 2012) was identified as an experimental error. Post-translational modifications were identified as a further adjusting screw of the PHB metabolism. PhaC1 and PhaZa1 were screened for the presence of phosphorylated residues. Ten different phosphorylations of PhaC1 were identified under PHB degrading conditions (at residues S10, T11, S16, T30, T94, T109, S149, S178, T191, S196, T198 and T373). T30, T94 and T109 were identified reproducibly in two different experiments while T373 was identified in all experiments. Site directed mutagenesis revealed that T373 influences the activity of PhaC1 in vitro, but that a combined mutagenesis of different residues is necessary to have a detectable impact in vivo. The residue S35 of PhaZa1 was phosphorylated at all stages of cell growth and detected in three independent experiments. Phosphorylations at the residues T26 and T28 were identified in one experiment. Modification of the residues T26 and S35 of PhaZa1 strongly reduced the PHB degrading activity.