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    Neue Einblicke in die Funktionalität PHB-Granula-assoziierter Proteine in Ralstonia eutropha H16
    (2018) Schulze, Stephanie; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr. rer. nat.)
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    Regulation der Gene für die Verwertung von Rhamnose und Heteromannan in Bacillus subtilis
    (2019) Habersetzer, Stefanie; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr. rer. nat.)
    In dieser Arbeit wurde die Regulation der Gene für die Verwertung von L-Rhamnose (rhaEWRBMA) und der Hemicellulose Heteromannan (gmuBACDREFG) in Bacillus subtilis untersucht. Die Abbaugene sind jeweils in einem Operon mit einem internen Regulatorgen (rhaR bzw. gmuR) zusammengefasst. Die Regulation des Rhamnose-Promotors (PrhaEW) wurde mittels lacZ-Reporteranalysen untersucht. PrhaEW wird durch den DeoR-ähnlichen Regulator RhaR negativ reguliert und durch Rhamnose induziert. Außerdem unterliegt die Expression des Rhamnose-Operons der Kohlenstoff-Katabolitrepression und wird bei gleichzeitiger Anwesenheit einer bevorzugten Kohlenstoffquelle wie Glucose über eine funktionelle cre-Sequenz (für catabolite responsive element) innerhalb von PrhaEW unterdrückt. L-Rhamnose wird in B. subtilis durch 5 enzymatisch katalysierte Schritte zu L-Lactat und Dihydroxyacetonphosphat umgesetzt. Durch Deletion der einzelnen Strukturgene wurde in vivo gezeigt, dass das phosphorylierte Intermediat Rhamnulose-1-Phosphat (R1P) der eigentliche Induktor ist. Mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wurde die spezifische Interaktion des Repressors RhaR mit seinem Operator stromaufwärts des ersten Gens nachgewiesen. In Abhängigkeit von der RhaR-Konzentration konnte die Bildung von zwei unterschiedlich großen PrhaEW-RhaR-Komplexen beobachtet werden, die in Gegenwart des Effektormoleküls R1P wieder dissoziierten. In DNase I-Footprinting-Experimenten wurden zwei durch RhaR geschützte Bereiche identifiziert. Der erste, größere Sequenzabschnitt (38-45 nt) enthält eine direkte Sequenzwiederholung aus zwei 17 bp langen Sequenzen CAAAAA(T/C)AAACA(A/G)AAA(C/T), die unerlässlich für die RhaR-Bindung ist. Diese RhaR-Bindestelle konnte auch durch eine Deletionsanalyse von PrhaEW sowie durch komplementäre Basensubstitutionen, die blockweise eingeführt wurden, bestätigt werden. In der kürzeren zusätzlich durch RhaR geschützten Region (22 nt) tritt das von der ersten Bindestelle abgeleitete 17 bp lange Sequenzmotiv CAAAAACAAACANAAAT mit wenigen Abweichungen erneut auf. Eine Gel-Permeations-Chromatographie ergab, dass RhaR in Lösung als Monomer vorliegt. Daher binden in Abwesenheit von Rhamnose vermutlich drei RhaR-Monomere an diese drei direkt wiederholten Sequenzen im Bereich der -35 und der -10 Region und verhindern die Bindung der RNA-Polymerase. Die Tatsache, dass B. subtilis mit Rhamnose als einziger Kohlenstoffquelle kaum wächst, könnte an dem Fehlen eines Transporters liegen. Durch die heterologe Expression eines Gens für eine mutmaßliche Rhamnose-Permease (rhaY) aus Oceanobacillus iheyensis konnte das Wachstum auf Rhamnose deutlich verbessert werden. Warum aber dafür eine extrem lange Adaptationszeit nötig war, konnte nicht geklärt werden. Das Glucomannan-Operon (gmu-Operon) von B. subtilis kodiert für Gene, die mutmaßlich für die Regulation, die extrazelluläre Hydrolyse von β-1,4-Heteromannan-Polysacchariden sowie die Aufnahme und den Abbau der dabei entstehenden oligomeren β-Mannoside verantwortlich sind. Hier durchgeführte genetische Analysen deuten darauf hin, dass die Oligosaccharide intrazellulär bis zum Monomer D-Mannose hydrolysiert werden. Durch Promotorstudien mit lacZ als Reporter und dem einzigen, vor dem ersten Gen gmuB liegenden Promotor (PgmuB) wurde gezeigt, dass das gmu-Operon neben Glucomannan auch durch Galactomannan induziert werden kann. Die Messungen der Promotoraktivität in Stoffwechselmutanten der Heteromannan-Verwertung lassen darauf schließen, dass es sich bei dem Effektormolekül des Repressors GmuR um ein phosphoryliertes Abbauprodukt der extrazellulären Mannanase GmuG (vermutlich β-1,4-Mannobiose) handelt, welches durch Aufnahme über ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Transportsystem entsteht. Durch EMSA wurde gezeigt, dass der GntR/HutC-ähnliche Repressor GmuR an seinen Operator stromaufwärts des gmu-Operons bindet und dabei, abhängig von der Proteinkonzentration, nacheinander zwei PgmuB-GmuR-Komplexe mit unterschiedlicher Mobilität ausbildet. Dieser Arbeit vorausgegangene bioinformatische Studien sagten eine 18 bp lange Bindestelle für GmuR vorher (IR1), die mittig das konservierte DNA-Motiv der HutC-Familie (GTNTANAC) enthält. Diese zentrale Sequenz, welche mit der -35 Region überlappt, wird von zwei inversen 7 bp langen Wiederholungen umgeben. Der entsprechende Bereich wurde im DNase I-Footprinting-Experiment durch GmuR geschützt. Allerdings folgte auf den 37 nt großen Abschnitt ein zusätzlicher kleinerer geschützter Abschnitt (10 nt) der die -10 Region bedeckt. Dieser Bereich enthält eine weitere invertierte Wiederholung des 7 bp langen DNA-Motivs TAAWWGT mit geringen Nukleotidabweichungen (‘IR2). Durch komplementäre Basensubstitutionen wurde bestätigt, dass diese Sequenz Einfluss auf die Affinität von GmuR hat. Ein Modell wurde vorgeschlagen, bei dem ein GmuR-Dimer an IR1 und ein weiteres an ‘IR2 bindet, wodurch die Bindung der RNA-Polymerase an den gmuB-Promotor blockiert wird.