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    Identifizierung zweier Gencluster (atuABCDEFGH, liuRABCDE) in Pseudomonas aeruginosa PAO1 und deren funktionelle Analyse im Metabolismus methylverzweigter Verbindungen
    (2006) Höschle, Birgit; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr.)
    Azyklische Terpene wie Citronellol und Geraniol sind in der Natur weit verbreitete Geruchsstoffe, die aufgrund ihrer β-methylverzweigten Struktur von Mikroorganismen nur schwer metabolisiert werden können. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau azyklischer Terpene in Pseudomonas aeruginosa PAO1 untersucht. 1. Durch Insertionsmutagenesen wurden zwei Gencluster identifiziert, die für die meisten der in früheren biochemischen Beiträgen postulierten Abbauschritte codieren. Das erste Gencluster besteht aus acht Genen und einem potentiellen Regulatorgen und entspricht den Genprodukten der ORF PA2885 bis PA2993 der P. aeruginosa PAO1 Datenbank. Das zweite Gencluster (gny-Cluster), welches durch Diaz-Perez und Mitarbeiter identifiziert wurde [DIAZ-PEREZ et al. (2004), Appl Environ Microbiol 70: 5102] besteht aus fünf Genen und einem vermeintlichen Regulatorgen und entspricht den Genprodukten der ORF PA2016 bis PA2011. 2. Insertionen im ersten Gencluster (PA2890 und PA2891) führten zu einem Verlust des Wachstums auf azyklischen Terpenen, die Fähigkeit zum Wachstum auf Leucin und Isovaleriansäure war nicht beeinträchtigt. Insertionen im zweiten Gencluster (PA2012 und PA2013) führten hingegen zum Verlust des Wachstums sowohl auf azyklischen Terpenen (Citronellol, Geraniol) als auch auf Leucin und Isovaleriansäure. Das erste Gencluster wurde als atu- (acyclic terpene utilization) Gencluster bezeichnet, das gny-Cluster wurde in das liu- (leucine/isovalerate utilization) Gencluster umbenannt. 3. Der aus biochemischen Untersuchungen postulierte Abbauweg von Citronellol enthält zwei charakteristische Carboxylierungsschritte (Geranyl-CoA-Carboxylase [GCase] und Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase [MCase]). Diese wandeln die β-Methylverzweigungen in Acetatseitengruppen um, welche in anschließenden enzymatischen Reaktionen abgespalten werden. Beide Carboxylasen wurden durch Avidin-Affinitätschromatographie aus Zellextrakten gereinigt und durch Trypsin-Fingerprint-Massenspektrometrie als Genprodukte von PA2888/PA2891 (atuD/atuF; GCase) bzw. als Genprodukte von PA2014/PA2012 (liuB/liuD; MCase) eindeutig identifiziert. Durch Western-Blot Analysen und Aktivitätsbestimmungen der GCase und MCase wurde bestätigt, dass die GCase (AtuF) nur beim Wachstum auf Citronellol, die MCase (LiuD) sowohl beim Wachstum auf Citronellol als auch beim Wachstum auf Leucin bzw. Isovaleriansäure induziert wurde. 4. Für die übrigen Genprodukte des atu- und liu-Genclusters konnten die möglichen biochemischen Funktionen durch Datenbankvergleiche vorhergesagt werden. 5. Vorausgesagte Genprodukte mit hohen Ähnlichkeiten zu den Genprodukten des liu-Clusters konnten in anderen Pseudomonaden (P. putida KT2440, P. fluorescens Pf-5, P. syringae tomato DC3000) nachgewiesen werden. Vorausgesagte Proteine mit hohen Ähnlichkeiten zu den Genprodukten des atu-Clusters konnten nur in P. fluorescens Pf-5 festgestellt werden, der als einziger dieser Pseudomonaden in der Lage ist, Citronellol als Kohlenstoffquelle zu verwerten. 6. Das atu-Cluster aus P. aeruginosa PAO1 konnte in die Pseudomonaden P. putida, P. fluorescens GK13 und P. oleovorans übertragen werden. Keiner dieser rekombinanten Stämme war anschließend in der Lage, Citronellol und Geraniol als Kohlenstoffquelle verwerten, so dass offenbar noch weitere, bislang unbekannte Gene für einen funktionellen Abbauweg notwendig sind. 7. Die Untersuchungen von weiteren Transposoninsertionsmutanten und Hemmversuche mit Wolframat ergaben, dass die Oxidation von Geraniol über molybdänabhängige Schritte verläuft, und somit unterschiedlich zur Oxidation von Citronellol ist. Weiterhin zeigte sich, dass das moeA2-Gen (ORF PA3028), welches an der Molybdäncofaktor-Biosynthese beteiligt ist, für die Verwertung von Geraniol essentiell ist.