Browsing by Author "Kauffmann, Isabelle Melanie"

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Open Access
DNA isolation from soil samples for cloning in different hosts
(2004) Kauffmann, Isabelle Melanie; Schmitt, Jutta; Schmid, Rolf D.
Many protocols to extract DNA directly from soil samples have been developed in recent years. We employed two extraction methods which differed in the method of lysis and compared these methods with respect to yield, purity and degree of shearing. The main focus was on the specific isolation of DNA from different microorganisms, especially DNA from actinomycetes, as these cells are very difficult to lyse in contrast to non-actinomycetes. Thus, we used both methods to isolate DNA from Pseudomonas (Entcheva et al. 2001), Arthrobacter and Rhodococcus (Borneman et al. 1996) and from soil spiked with the respective microorganisms. Both methods rendered high DNA yields with a low degree of shearing but differed in the type of cells that were lysed. By one protocol (utilizing enzymatic lysis) only DNA from the Gram-negative Pseudomonas strain could be obtained whereas by the other protocol (utilizing mechanical lysis), all microorganisms that were used could be lysed and DNA from them extracted. Using a combination of both protocols, DNA from those organisms could be obtained selectively. Furthermore, one of the protocols was modified, resulting in higher DNA yield and purity.
Open Access
Erhöhung der mikrobiellen und molekularen Diversität von Carotinoiden
(2002) Kauffmann, Isabelle Melanie; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Carotinoide sind meist gelbe bis rote Farbstoffe, die in der Natur weit verbreitet sind. Sie werden derzeit als Tierfutterzusatz, Nahrungsergänzungsmittel und für pharmazeutische und kosmetische Produkte eingesetzt. Jedoch ist das Angebot strukturell verschiedener Carotinoide für medizinische Zwecke gering, und nur eine begrenzte Anzahl von Carotinoiden ist chemisch herzustellen, aus natürlichen Quellen zu isolieren oder zu fermentieren. Zunächst wurde in dieser Arbeit versucht, die mikrobielle Diversität von Carotinoiden zu erhöhen, indem Genbanken aus Boden-DNA auf Carotinoidbildung gescreent wurden. Dazu wurden verschiedene, sich im Aufschlußprinzip unterscheidende Methoden zur Extraktion von DNA aus Bodenproben miteinander verglichen. Dabei sollte erreicht werden, daß DNA aus Actinomyceten von DNA aus Gram-negativen Mikroorganismen abgetrennt werden kann, da die Expression von Actinomyceten Genen in E. coli wie auch die Expression von Genen aus Gram-negativen Organismen in Actinomyceten aufgrund unterschiedlicher Promotoren und Codon-usage oft problematisch ist. Durch die Kombination der Methoden nach Zhou und Moré konnte dies erreicht werden. Darüber hinaus wurde für die nach Moré isolierte DNA ein direktes Reinigungsprotokoll etabliert, wodurch die DNA ohne vorherige Fällung direkt mit Silica aus dem Lysat isoliert und gereinigt werden kann. Die anschließende Klonierung der nach Zhou isolierten DNA wurde in E. coli Zellen durchgeführt, die die beiden Carotinoid Gene crtB und crtE aus Erwinia uredovora auf einem Plasmid enthielten. Diese Zellen bilden bereits das farblose Carotinoid Phytoin. Durch Komplementationsscreening sollten nun Klone identifiziert werden, die weitere Gene für die Carotinoid Biosynthese tragen und deren Genprodukte Phytoin als Substrat nutzen können. So wäre die Identifizierung über eine Gelb- oder Rotfärbung des entsprechenden Klons möglich. Beim Screening von 70 000 Klonen konnte keiner identifiziert werden, der eine Gelb- oder Rotfärbung aufwies. Um eventuell auftretende systematische Fehler auszuschließen, wurde der Bodenprobe zur Validierung der Methode 1 ml E. uredovora-Kultur (entsprechend 5,5 x 108 Zellen) zugegeben, aus der anschließend DNA isoliert und die Genbank erstellt wurde. Beim Komplementationsscreening wurden unter 7 000 gescreenten Klonen vier identifiziert, die eine Gelborangefärbung aufwiesen, die von der Bildung von b-Carotin herrührt. Diese b-Carotin-Bildung war darauf zurückzuführen, daß die beiden Gene crtI und crtY, die im Genom von E. uredovora benachbart liegen, kloniert worden waren. Dies führt bei Komplementation mit den beiden Genen crtE und crtB, die in E. coli vorgelegt worden waren, zur Biosynthese von b-Carotin. Zur Erhöhung der molekularen Diversität von Carotinoiden wurde zunächst durch DNA shuffling zweier homologer Gene, die für Spheroiden Monooxygenasen codieren, versucht, die Substratspezifität dahingehend zu verändern, daß als bevorzugtes Produkt Carotinoide entstehen, die eine möglichst hohe Anzahl an Ketogruppen tragen. Die beiden Spheroiden Monooxygenasen (crtA) aus Rhodobacter capsulatus und Rhodobacter sphaeroides können die Carotinoide, die bei Expression der in E. coli vorgelegten Gene crtB, crtE und crtI-C14 (eine crtI-Mutante, die durch DNA shuffling zweier homologer crtI-Gene erzeugt worden war) gebildet werden, als Substrat nutzen und zu Oxo-Produkten umsetzen. Die Genprodukte von crtE, crtB und crtI-C14 führen in E. coli zur Bildung eines Gemisches aus Lycopin und 3,4,3´,4´-Tetradehydrolycopin was eine Pinkfärbung des entsprechenden Klons hervorruft. Bei den entsprechenden Oxo-Derivaten handelt es sich um unterschiedliche Produkte, da Klone, die die Gene crtB, crtE und crtI-C14 und den entsprechenden crtA-Wildtyp exprimieren, unterschiedliche Färbungen aufweisen. Es wurden 24 000 Klone der durch DNA shuffling erzeugten Mutantenbibliothek gescreent, wobei keiner im Vergleich zu den jeweiligen Wildtypen eine veränderte Färbung aufwies. In einem weiteren Ansatz wurde der Carotinoid Biosyntheseweg in E. coli durch die auf einem Plasmid codierten Gene crtB, crtE, crtI-C14 und crtY bis zum b-Carotin verlängert. Klone mit diesem Plasmid weisen eine Gelborangefärbung auf, die auf die Bildung von b-Carotin zurückzuführen ist. Die b-Carotin-Ketolase CrtO aus Synechocystis sp. PCC6803 (SYO) kann b-Carotin zu dem Ketocarotinoid Echinenon umsetzen. Durch Komplementationsscreening einer durch error-prone PCR erzeugten Mutantenbibliothek von SYO sollten Mutanten erzeugt werden, die zur Bildung von Canthaxanthin anstatt Echinenon führen. Diese sind durch eine veränderte Färbung bei visuellem Screening identifizierbar. In dieser Arbeit wurden 35 000 Klone gescreent, wobei keiner eine Farbänderung aufwies. Bei näherer Untersuchung zeigte sich allerdings, daß durch veränderte Kultivierungsbedingungen auch der SYO-Wildtyp in der Lage ist, Canthaxanthin als Hauptprodukt zu produzieren.