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Determining the functions of transcriptional regulatory genes of the npd gene cluster encoding 2,4,6-trinitrophenol degradation in Rhodococcus opacus HL PM-1
(2004) Dang, Phuong Nga; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)
Rhodococcus opacus HL PM-1 utilises 2,4,6-trinitrophenol (TNP) and 2,4-dinitrophenol (DNP) as a sole carbon, nitrogen and energy source. The TNP metabolic enzymes are encoded by the npd gene cluster. The initial attack on TNP is two hydrogenation reactions, which are catalysed by hydride transferase I (encoded by npdC) and hydride transferase II (encoded by npdI) and the NADPH-dependent F420 reductase (encoded by npdG). In this work, three open reading frames, orfA1, orfA2 and npdR were of interest. Database searches with the deduced amino acid sequences from npdR, orfA1 and orfA2 suggested that npdR may encode for a transcriptional regulator of the IclR family, and orfA1 and orfA2 may encode for two components of a signal transduction protein. The npdR gene was expressed in E. coli, the protein was purified and shown to bind to intergenic regions between orfA1 and orfB, and between npdH and npdI. DNP, TNP, 2-chloro-4,6-dinitrophenol, and 2-methyl-4,6-dinitrophenol induced the expression of npdI and npdC by reducing the binding affinity of NpdR to the DNA-binding regions. Both intergenic regions were cloned upstream of a reporter gene (xylE), causing the expression of xylE. Hence, both intergenic regions contain promoters. Two direct repeats were identified immediately downstream of the two promoter regions. Gel retardation assays with one of the direct repeats between orfA1 and orfB demonstrated that it was the binding site for NpdR. The sequences of the two direct repeats were 82 % identical, suggesting that the second direct repeat between npdH and npdI may be a second binding site for NpdR. This coincided with gel retardation assays, which showed that NpdR might bind to two sites in each intergenic region. A deletion mutant for npdR in R. opacus HL PM-1 was constructed, in which an internal part of npdR was deleted. The expression of npdC and npdI were induced by DNP in the wild-type strain, but were constitutive in the mutant. Hence, NpdR is a repressor involved in TNP degradation. In vivo deletion mutants for orfA1 or orfA2 were also constructed, in which the entire orfA1 or a part of orfA2 was deleted. If orfA1 and orfA2 encode for transcriptional regulators involved in TNP degradation, an effect on expression of the npd genes or on the growth with TNP would be expected in the mutants. However, there was no change in the expression of npdC or npdI in both mutant strains. Resting cells of the deletion mutants for orfA1 or orfA2 with TNP as a substrate did not show any difference in TNP conversion compared to the wild-type cells. Further growth rate of the mutants on TNP as nitrogen source was also similar to that of the wild-type strain. In order to eliminate the possibility of a second copy of orfA1 or orfA2 with full activity in strain HL PM-1, the location of npd genes was determined. npdC, npdI, npdR, orfA1 and orfA2 were localised on the chromosomal DNA in strain HL PM-1. Hybridisation analysis of total DNA from strain HL PM-1 with npdR, orfA1 or orfA2 probes revealed that these genes are present as a single copy in the strain. Hence, orfA1 and orfA2 seem not to be involved in TNP degradation. To conclude, it was shown that NpdR is a repressor of TNP degradation, that two promoter regions are present in the npd gene cluster, and that orfA1 and orfA2 are not involved in metabolism of TNP as nitrogen source.
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Enzyme, Gene und Mechanismen des oberen Abbauweges von Pikrinsäure und 2,4-Dinitrophenol durch Nocardioides simplex FJ2-1A
(2001) Ebert, Sybille; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)
Der Bakterienstamm Nocardioides simplex FJ2-1A baut 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP) und Pikrinsäure unter aeroben Bedingungen vollständig ab. Hydrid wird auf den aromatischen Ring des Nitroaromaten übertragen. Dabei entsteht der jeweilige Hydrid-Meisenheimer-Komplex als Produkt. Diese initiale Reduktion wird von einem Enzymsystem katalysiert. Koenzym F420, welches als methanogener Kofaktor bekannt ist, wurde als Mediator der Hydridübertragung identifiziert. Von NADPH wird Hydrid mittels einer NADPH-abhängigen F420-Reduktase auf Koenzym F420 übertragen. Der sich anschließende Hydridtransfer auf das aromatische System des Nitroaromaten wird durch eine Hydridtransferase katalysiert. Die N-terminalen Sequenzen der Proteine dienten zur Ableitung von Oligonukleotiden für die Herstellung einer Sonde mittels PCR. Ein 7.2 kb großes DNA Fragment, das die Gene der beiden Enzyme beinhaltet, wurde isoliert und sequenziert. Bei Datenbankvergleichen zeigt die F420-Reduktase Ähnlichkeiten zu F420-abhängigen NADP+-Reduktasen aus Archaea und Streptomyceten. Die Hydridtransferase ist N5,N10-Methylen-tetrahydromethanopterin-Reduktasen ähnlich. Der Dihydrid-Komplex von Pikrat wurde als Produkt einer zweifachen Hydridübertragung auf das aromatische Ringsystem von Pikrat durch das Enzymsystem identifiziert. Der Dihydrid Komplex des Pikrats wurde 1H- und 13C-NMR spektroskopisch untersucht. Er wird enzymatisch unter Elimination von Nitrit und der Bildung des Hydrid-Meisenheimer-Komplexes von 2,4-DNP umgesetzt. Die nitriteliminierende Aktivität wurde mit FPLC angereichert. Als Produkt der Reduktion von 2,4-DNP durch das Hydrid übertragende Enzymsystem entsteht der korrespondierende Hydrid-Meisenheimer-Komplex. Als Folge dieser Untersuchungen ergibt sich für Nocardioides simplex FJ2-1A ein konvergenter Abbauweg von Pikrat und 2,4-DNP.
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Enzymes and metabolites in picric acid (2,4,6-trinitrophenol) and 2,4-dinitrophenol biodegradation
(2003) Hofmann, Klaus W.; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)
The bacterial strains Rhodococcus (opacus) erythropolis HL PM-1 and Nocardioides simplex FJ2-1A can use picric acid (TNP) and 2,4-dinitrophenol (DNP) as sole nitrogen source. Enzymes were identified which are isofunctional in both strains, using the same degradation mechanism. During the initial steps hydride ions were transferred to the aromatic ring of the electron deficient p-system, forming first the hydride s-complex of TNP, H--TNP, and subsequently the dihydride s-complex, 2H--TNP. The reactions were catalyzed by hydride transferase II (HTII) and hydride transferase I (HTI), respectively, together with the NADPH-dependent F420 reductase (NDFR) and the coenzymes NADPH and F420. NDFR, HTII, and HTI were cloned and purified as His-tag fusion proteins by Ni-NTA affinity chromatography. Reactions were followed by repeated recording of UV-visible spectra, and intermediates were identified by HPLC, HPLC-MS, and NMR measurements. H--TNP and 2H--TNP were chemically synthesized and used as standards and substrates. In the next step, a nitrite-eliminating enzyme releasing nitrite from 2H--TNP and generating the hydride s-complex of DNP (H--DNP) was identified. A tautomerase was shown to give rise to two tautomeric forms, the aci-nitro form and the nitro form of 2H--TNP, identified by HPLC and NMR measurements. Since the nitrite-eliminating enzyme used only the aci-nitro form as a substrate, it appears that the 2H--TNP tautomerase inhibits accumulation of the nitro form. Whereas the 2H--TNP tautomerase was cloned and purified as a His-tag fusion protein, the nitrite-eliminating enzyme was isolated by FPLC and the N-terminal sequence was determined. Databank search exhibited no similarities to any known proteins. HTI and NDFR, together with the coenzymes NADPH and F420, hydrogenated chemically synthesized H--DNP to 2H--DNP. It was shown by HPLC-MS that 2,4-dinitrocyclohexanone (2,4-DNCH) was generated after protonation. A hydrolase was purified by FPLC, catalyzing hydrolytic ring fission of 2,4-DNCH, forming 4,6-dinitrohexanoate (4,6-DNH). 4,6-DNH was identified by HPLC-MS. MALDI-TOF measurements showed that the 2,4-DNCH hydrolase consists of four identical subunits. Since determination of the N-terminal amino acid sequence exhibited that the corresponding gene was located on the known gene clusters of both strains, the gene function was recognized. Activity for the conversion of 4,6-DNH in crude extracts identified 4,6-DNH as a true intermediate of the degradation pathway of TNP and DNP.
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Herstellung von 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat aus Toluol : Konstruktion von Stämmen für die selektive Hydroxylierung
(2003) Gittinger, Simone; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein biotechnisches Verfahren zur selektiven Hydroxylierung von Kohlenwasserstoffen zu entwickeln. Als Beispiel für einen derartigen Prozess sollte die Herstellung von Phenol aus Toluol ermöglicht werden. Für die Produktion von Phenol aus Toluol ist ein zweistufiges Verfahren notwendig: Die Biotransformation von Toluol zu Benzoatdihydrodiol (cis-Cyclohexa-3,5-dien-1,2-diol-1-carboxylat oder 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat) und die anschließende mit Säure katalysierte Umsetzung von Benzoatdihydrodiol zu Phenol. Für die Bereitstellung eines geeigneten Biokatalysators sollten in einen toluoltoleranten Stamm, der weder Toluol noch Benzoatdihydrodiol verwerten konnte, die erforderlichen Gene auf einem Transposon oder Plasmid integriert werden. Da zu Beginn dieser Arbeit kein geeigneter toluoltoleranter Bakterienstamm isoliert werden konnte, wurden die Gene für die Toluoloxidation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Von diesen Stämmen war bekannt, dass sie im Stoffwechsel von Benzoat auf der Stufe des Benzoatdihydrodiols bereits blockiert waren. Es konnte nachgewiesen werden, dass beide Stämme Toluol nicht oxidierten. Allerdings zeigten sie nur eine sehr geringe Toleranz gegenüber Toluol. Die zusätzlichen Gene für die Transformation von Toluol zu Benzoat wurden mit Hilfe des rekombinanten Plasmids pCK05 (Panke et al., 1998) übertragen. Dieses Plasmid trägt auf einem Transposon die erforderlichen Struktur- und Regulatorgene aus dem TOL-Plasmid pWW0 von P. putida mt-2. Mittels Konjugation konnte die Genkassette stabil in das bakterielle Chromosom von R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 integriert werden. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten Toluol und Benzylalkohol zu Benzoatdihydrodiol. Dagegen setzten Transkonjuganten von R. eutropha B9 nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Zusätzlich wurden die Gene für die Oxidation von Toluol zu Benzoat extrachromosomal auf einem Plasmid in die beiden Stämme eingebracht. Dazu wurde die Genkassette in "broad-host-range" Vektoren kloniert. Die konstruierten Plasmide pBBSG1 und pMMSG6 wurden ebenfalls mittels Konjugation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Transkonjuganten von R. eutropha B9 setzten wiederum nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten zwar Toluol zu Benzoatdihydrodiol, allerdings konnten im Vergleich zu den Transkonjuganten mit den zusätzlichen Genen im Chromosom keine besseren Umsatzraten erreicht werden. Die Expression der Gene wurde auch in E. coli DH5a untersucht. Hierfür mussten neben den Genen der Enzyme für die Oxidation von Toluol zu Benzoat auch die Gene für die Benzoat-Dioxygenase kloniert werden. In dieser Arbeit gelang es nicht, die Gene für die Enzyme des vollständigen Abbauweges auf einem Plasmid bereitzustellen. Die Gene für die Oxidation von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol konnten aber separat auf einem weiteren Plasmid (pBBSG2) kloniert werden. Somit standen zwei verschiedene rekombinante E. coli DH5a-Stämme zur Verfügung: einer für die Transformation von Toluol zu Benzoat und ein weiterer für den Umsatz von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol. Eine Mischkultur aus beiden rekombinanten Stämmen setzte Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Des weiteren war es gelungen, die beiden Plasmide zusammen in einen Stamm (ebenfalls E. coli DH5a) zu transformieren. Auch mit diesem Konstrukt konnte Toluol zu Benzoatdihydrodiol umgesetzt werden. Die geringe Toluoltoleranz von P. putida U-JT103 und E. coli DH5a während des Umsatzes von Toluol zu Benzoatdihydrodiol führte zu einer hohen Instabilität der konstruierten Stämme. Die Ausbeuten an Benzoatdihydrodiol lagen zwischen 70 und 99 %. P. putida U_TP10 (Transkonjugante mit der Genkassette im Chromosom) wurde für einen möglichen Einsatz als Biokatalysator in einem großtechnischen Prozess weiter untersucht. Mit den Ergebnissen konnte eine volumetrische Reaktorproduktivität von 0,02 mol×l-1×h-1 abgeschätzt werden. Aufgrund der geringen Produktivität und hohen Instabilität des Biokatalysators ist ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung des Massenprodukts Phenol gegenüber den etablierten chemischen Verfahren aus wirtschaftlicher Sicht nicht konkurrenzfähig. Allerdings können die konstruierten Stämme für die Produktion von chiralen Diolen eingesetzt werden, die chemisch nur mit unvergleichlich hohem Aufwand herzustellen sind.
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Herstellung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol: Konstruktion und Charakterisierung einer Mutante des Lösungsmittel tolerierenden Pseudomonas putida Idaho
(2002) Germer, Andrea; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)
Zur biotechnologischen Produktion der Bulkchemikalie Phenol wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Mutante des Bakterienstammes P. putida Idaho konstruiert, mit welcher aus Toluol Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol als Precursor für die weitere Umsetzung zu Phenol hergestellt werden sollte. In P. putida Idaho ist das gewünschte Produkt Metabolit des Abbauweges von Toluol. Im Wildtypstamm P. putida Idaho wird Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durch zwei Dehydrogenasen, die in verschiedenen Genclustern codiert sind, zu Brenzcatechin umgesetzt. Die Toluat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase XylL, die im meta-Operon codiert ist, wurde durch eine Deletion im Gen xylL inaktiviert, in Gen benD der Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase des b-Ketoadipatweges wurde zusätzlich zu einer Deletion ein Antibiotikaresistensmarker, das W-Fragment, eingefügt. Mit dieser Mutante P. putida Idaho BDH2 wurden Umsatzexperimente von Toluol zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Mutante trotz Inaktivierung der beiden Gene, welche das Produkt in Wildtypstamm weiter abbauen, immer noch in der Lage ist, Toluol als Wachstumssubstrat zu nutzen. Aus dem angebotenen Toluol entstand außerdem nur 25-40 % des erwarteten Produktes, das nach etwa 4 Tagen unter weiterer Bildung von Biomasse wieder abgebaut wurde. Wurde statt Toluol Benzylalkohol oder Benzoat angeboten, wurde Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol zu nahezu 100 % gebildet. Auch während des Umsatzes dieser beiden Substrate konnte eine sehr schwache Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden. Wie im Ansatz mit Toluol wurde auch in diesen Ansätzen das gebildete Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol nach einigen Tagen unter Wachstum der Zellen wieder abgebaut. Durch Enzymtests mit Rohextrakten der Doppelmutanten von P. putida Idaho konnte eine sehr schwache aber signifikante Aktivität eines Enzyms, das Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol umsetzen kann, nachgewiesen werden, was den Abbau des gebildeten Produktes erklärt. Ob die Bilanzlücke bei der Bildung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol allein dieser Aktivität zugrunde liegt, ist nicht geklärt. Ein zusätzlicher Abbauweg von Toluol in P. putida Idaho der nicht über die Metabolite Benzylalkohol und Benzoat geht, konnte nicht nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass die Mutante P. putida Idaho BDH2, deren Biomasse mit dem Substrat Glucose produziert wurde, sich nur sehr schlecht mit Toluol induzieren ließ. Eine technische Produktion von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol mit P .putida Idaho ist, abgesehen vom unvollständigen Umsatz von Toluol ausgehend, weiterhin problematisch. Die Sequenzierung der beiden Gencluster mit den Dehydrogenasen zeigte, dass beide für den Umsatz zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol erforderlichen Dioxygenasen vorhanden waren. Die Gencluster aus P. putida Idaho zeigten Abweichungen von den sonst fast identischen Clustern, nämlich dem meta-Operon aus pWW0 und dem ß-Ketoadipatweg aus P. putida PRS2000. Diese Abweichungen könnten Hinweise auf eine andersartige Regulation für den Aromatenabbau als in den Wegen aus pWW0 oder P. putida PRS2000 bergen. Auch ist die Rekrutierung einer cis-1,2-Dihydrodiol-Dehydrogenase aus einem der beiden Gencluster an einen anderen Lokus des Chromosoms aus P. putida Idaho nicht ausgeschlossen.
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Mikrobieller Abbau von Iminodisuccinat
(2004) Cokesa, Zeljko; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)
Iminodisuccinat (IDS) ist ein neuer synthetisch hergestellter Komplexbildner mit dem Potenzial den meistbenutzten aber schwer abbaubaren Komplexbildner Ethylendiamin-tetraacetat (EDTA) teilweise zu ersetzen. Von einem EDTA-Substitut wird neben guten Komplexierungseigenschaften insbesondere eine gute biologische Abbaubarkeit verlangt. In diesem Zusammenhang wurde die Abbaubarkeit von IDS bewertet, die initialen Abbauwege aufgeklärt und die in den Abbau involvierten Gene charakterisiert. Standardisierte aerobe Abbautests nach OECD 301F (Respirometertest) zeigten je nach eingesetztem Belebtschlamm unterschiedliche Ergebnisse. Einerseits wurden mit dem Belebtschlamm aus der Kläranlage Leverkusen-Bürrig alle Isomere des IDS leicht abgebaut. Andererseits wurden nur zwei von drei IDS Isomeren, das R,S-IDS und S,S-IDS, mit dem Belebtschlamm aus der Kläranlage Stuttgart-Büsnau mineralisiert. Des Weiteren wurden die in der Natur hauptsächlich vorliegenden Metall-IDS Komplexe auf ihre biologische Abbaubarkeit untersucht. Dabei erwiesen sich Fe2+- und Ca2+-IDS als biologisch leicht abbaubar, während Mn2+- und Cu2+-IDS innerhalb der 28-tägigen Testperiode nur zu 55% bzw. 40% eliminiert wurden. Aus den genannten Belebtschlämmen wurden die IDS-abbauenden Stämme Agrobacterium tumefaciens BY6 (Leverkusen-Bürrig) und Ralstonia sp. SLRS7 (Stuttgart-Büsnau) isoliert und für weitere Untersuchungen verwendet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der standardisierten Abbautests mineralisierte der Stamm A. tumefaciens BY6 alle Isomere des IDS, der Stamm R. sp. SLRS7 nur die Isomere R,S-IDS und S,S-IDS. In R. sp. SLRS7 werden R,S-IDS und S,S-IDS über eine homotetramere C-N Lyase reversibel zu Asparaginsäure und Fumarsäure gespalten. Aus R,S-IDS entsteht D-Asparaginsäure, aus S,S-IDS L-Asparaginsäure. Die Spaltung der C-N Bindung erfolgt dabei stereospezifisch am S-konfigurierten C-Atom. In A. tumefaciens BY6 sind zwei Enzyme in den initialen Abbau der IDS Isomere involviert. Zum einen eine C-N Lyase mit vergleichbarer Funktion zur C-N Lyase aus R. sp. SLRS7. Sie katalysiert die stereoselektive Spaltung von R,S-IDS zu D-Asparaginsäure und Fumarsäure. Zum anderen wurde eine Epimerase gefunden. Diese ist das eigentliche Schlüsselenzym für die Metabolisierung von R,R-IDS. Sie epimerisiert R,R-IDS zu R,S-IDS sowie S,S-IDS zu R,S-IDS. Hierdurch werden die Isomere R,R-IDS und S,S-IDS in den stereoselektiven Pfad eingeleitet, der durch die C-N Lyase katalysiert wird. Die Gene für die Epimerase und die C-N Lyase aus A. tumefaciens BY6 wurden kloniert und sequenziert. Die von dem Lyase-Gen abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte die höchste Homologie mit Argininosuccinat-Lyasen, einer Unterfamilie der Fumarase II Superfamilie. Eine entsprechende Lyase-Aktivität gegenüber Arginiosuccinat wurde jedoch nicht beobachtet. Bei der C-N Lyase aus A. tumefaciens BY6 handelt es sich um ein nahe verwandtes Enzym der Argininosuccinat-Lyasen mit bisher unbekannter Hauptfunktion. Die von dem Epimerase-Gen abgeleitete Aminosäure-sequenz besaß keine signifikante Ähnlichkeit zu Proteinen mit bekannter Funktion. Die Epimerase kann demnach als neuartig bezeichnet werden. Die beiden in den IDS-Abbau involvierten Gene zeigten keine funktionelle Kopplung. Das Epimerase-Gen wurde auf einem zirkulären Plasmid, das Lyase-Gen auf der chromosomalen DNA lokalisiert.