Browsing by Author "Koschorreck, Katja"

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    Expression, Charakterisierung und Optimierung mikrobieller Laccasen für die Biokatalyse
    (2008) Koschorreck, Katja; Schmid, Rolf D. (Prof.)
    Laccasen (E.C. 1.10.3.2.) gehören zu den Multikupferoxidasen und katalysieren die Ein-Elektron-Oxidation von vier Substratmolekülen durch die Vier-Elektronen-Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Besonders aus Weißfäulepilzen wurden viele Laccasen beschrieben und in der Biokatalyse eingesetzt. Bisher wurden jedoch hauptsächlich natürlich vorkommende Mischungen von Laccasen aus Weißfäulepilzen und nicht isolierte Enzyme verwendet. In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb Laccasen aus verschiedenen Mikroorganismen exprimiert und charakterisiert sowie auf ihre Einsetzbarkeit in der Biokatalyse untersucht werden. Die Aktivität der Laccasen bei der oxidativen Kupplung phenolischer Säuren sowie der Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe stand dabei im Vordergrund. Zudem sollte die häufig geringe Expression der Laccasen verbessert und gemeinsam mit der Aktivität der Enzyme über gezielte Mutagenese oder Zufallsmutagenese gesteigert werden. Vier verschiedene Laccasen aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor, Lccalpha, Lccbeta, Lccgamma und Lccdelta, wurden erfolgreich in Pichia pastoris überexprimiert. Die Wahl der Signalsequenz zur Sekretion in P. pastoris sowie die Temperatur hatten einen großen Einfluss auf die Expression der Laccasen. Durch Hochzelldichte-Kultivierungen von P. pastoris wurden hohe Ausbeuten der Laccasen von bis zu 3400 U l–1 erzielt, die den biotechnologischen Einsatz dieser Enzyme realisierbar machen. Die biochemische Charakterisierung der Laccasen ergab, dass Lccalpha und Lccbeta bei Raumtemperatur wie auch bei höheren Temperaturen deutlich stabiler als Lccgamma und Lccdelta waren. Zudem zeigten die Laccasen sehr unterschiedliche katalytische Aktivitäten. Obwohl alle vier Isoenzyme die oxidative Phenolkupplung von 5 mM Sinapinsäure regioselektiv zum Dehydrodisinapinsäuredilakton katalysierten, zeigte Lccdelta mit 98% Umsatz nach 20 min die höchste Aktivität. Lccalpha, Lccbeta und Lccgamma wiesen nach 20 min 34%, 50% bzw. 48% Umsatz auf. Die Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasser-stoffe erfolgte hingegen am effektivsten mit Lccbeta. Durch Einsatz des Redoxmediators 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-Schwefelsäure) (ABTS) wurde mit Lccbeta nach 72 h über 80% Umsatz von 0,1 mM Anthracen, Acenaphthen und Acenaphthylen erzielt und damit deutlich bessere Ergebnisse erreicht als bisher mit Laccase-Mischungen aus T. versicolor und ABTS. Lccbeta wurde somit als stabilste Laccase aus T. versicolor mit hoher Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten identifiziert und ist potenziell für einen Einsatz in der Biokatalyse geeignet. Strukturelle Analysen der Laccasen und anschließende Mutagenese zeigten, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der Laccasen gegenüber polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen durch die Aminosäuren an Position 164 und 265 in der Substratbindetasche verursacht werden. Des Weiteren wurde eine neue Laccase aus Bacillus licheniformis identifiziert und erfolgreich in Escherichia coli überexprimiert. Das Enzym CotA katalysierte die oxidative Kupplung verschiedener phenolischer Säuren, allerdings war die Aktivität des Enzyms stark von der Alkylkettenlänge der Säureseitengruppe wie auch von den Substituenten in ortho-Position der Phenolgruppe abhängig. So wurden 5 mM Sinapinsäure, Kaffeesäure und Ferulasäure von CotA nach 120 min zu 66%, 22% bzw. 15% umgesetzt, während p-Cumarsäure, Zimtsäure und Vanillinsäure nicht oxidiert wurden. Als Hauptprodukte der Kupplungsreaktionen wurden Dimere der Säuren identifiziert. Die höchste Regioselektivität bei der oxidativen Phenolkupplung wurde bei der Oxidation von Sinapinsäure zum Dehydrodisinapinsäure-dilakton erreicht (79% Anteil am Gesamtprodukt). Syringasäure wurde von CotA ausschließ-lich zum 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinon oxidiert (22% Umsatz nach 120 min). CotA wurde durch Zufallsmutagenese (error-prone PCR) verändert und 6000 CotA-Varianten im Hochdurchsatzverfahren auf verbesserte Aktivität gegenüber ABTS untersucht. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurde anschließend über einen rationalen Ansatz die CotA-Variante K316N/D500G erzeugt. Diese konnte 11,4-mal so stark wie der Wildtyp exprimiert werden. Das bedeutet, dass circa 300 mg aktive Laccase aus 1 l E. coli-Kultur erhalten werden können. K316N/D500G zeigte zudem eine um circa 50% höhere spezifische Aktivität bei der oxidativen Phenolkupplung von Ferulasäure als der Wildtyp. Die Aktivität gegenüber Kaffeesäure war leicht erhöht (20% Umsatz gegenüber 18% Umsatz mit CotA). Außerdem wurden die Farbstoffe Remazol Brilliant Blue R, Alizarin Red S und Indigocarmin von K316N/D500G sowohl in An- wie in Abwesenheit des Redoxmediators Violursäure deutlich stärker entfärbt als von CotA-Wildtyp. Die verbesserten Eigenschaften der CotA-Variante K316N/D500G ermöglichen den Einsatz dieser bakteriellen Laccase in der Biokatalyse.