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    Gene Silencing und das Abutilon-Mosaik-Virus
    (2007) Krenz, Björn; Jeske, Holger (Prof. Dr.)
    Geminiviren richten weltweit einen großen ökologischen und ökonomischen Schaden an. Es gibt ein gesteigertes Interesse, Pflanzenpathogenen entweder durch konservative Mittel oder durch biotechnologische Nutzung von neuentdeckten Phänomenen, wie dem Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) Einhalt zu gebieten. Dies ist vielversprechend, weil PTGS ein pflanzeneigenes Abwehrsystem gegen Pathogene darstellt, das ubiquitär im Pflanzenreich verbreitet ist. Verschiedene PTGS-Auslöser zur Unterdrückung von Geminivirusinfektionen sollten hergestellt und charakterisiert werden. Dazu sollten Silencing-Konstrukte gegen eine Abutilon Mosaic Virus (AbMV)-Infektion entwickelt und eingesetzt werden, um letztendlich Wirtsfaktoren zu charakterisieren, die für eine geminivirale Infektion essentiell sind, zugleich aber die Wirtspflanze nicht in ihrer Entwicklung hemmen. Die DNA des AbMV wurde dazu als Gene Silencing- und Proteinexpressionsvektor umkonstruiert und mit Hilfe des Markergens Phytoendesature (PDS) und des Reportergens Green Fluorescence Protein GFP funktionell überprüft. In die infektiöse Hüllprotein-Deletionsmutante von AbMV wurde ein cDNA-Fragment von Phytoendesaturase (PDS) inseriert. Inokulierte Nicotiana benthamiana-Pflanzen zeigten im Verlauf der Infektion den erwarteten Albino-Phänotyp, der durch PDS-Silencing entsteht. Der offene Leserahmen (ORF) von GFP wurde in die gleiche AbMV-Mutante inseriert und führte zur Expression von GFP unter der Kontrolle des Hüllprotein-Promotors sowohl in Agrobakterium-infiltriertem Gewebe, als auch in systemisch infizierten Geweben, so dass AbMV als Gene Silencing- und Proteinexpressionsvektor genutzt werden kann. Im Hefe-2-Hybrid-System konnte Dr. T. Kleinow nachweisen, dass die N-terminale Domäne des movement protein (MP) von AbMV mit dem C-terminalen Bereich des Chloroplasten-lokalisierten Hitzeschock-Proteins von 70 kDa (cpHsc70) aus Arabidopsis thaliana interagiert. Um zu überprüfen, wie sich ein cpHsc70-knock down Phänotyp auf eine AbMV-Infektion auswirkt, wurde das etablierte AbMV-basierte Silencing-Vektorsystem genutzt. Als Silencing-Phänotyp konnten entlang der Leitgewebe systemisch infizierter N. benthamiana-Blätter kleine weiße Chlorosen beobachtet werden, die auf die Degradation der Chloroplasten zurückgeführt werden konnten. In cpHsc70-gesilencten Pflanzen akkumulierte zudem signifikant weniger single-stranded DNA (ssDNA), als in den Kontroll-Proben, so dass über einen Effekt von cpHsc70-silencing auf virale ssDNA spekuliert werden kann. Eine Interaktion von cpHsc70 mit dem AbMV-Transportkomplex als Grundlage für den Transport von geminiviraler DNA über Membranen wird diskutiert. Über die Eigenschaften des AbMV Transkriptions-Transaktivator Proteins (TrAP) als Silencing-Suppressor ist noch nichts bekannt. Die Funktion als Silencing-Suppressor oder dessen Interferenz mit der Silencing-assoziierten Maschinerie sollte charakterisiert werden, um gezielt Resistenz oder Toleranz zu etablieren. Eine GFP-Expressionskassette wurde zwischen zwei virale Replikationsursprünge inseriert und stabil in eine N. benthamiana-Pflanze als Transgen integriert, so dass durch Infektion mit AbMV ein Transreplikon aus dem Transgen mobilisiert werden konnte, das GFP exprimiert. In AbMV-infizierten Pflanzenzellen konnten GFP-Signale im Leitgewebe beobachtet werden und bestätigten damit die Mobilisierung und Replikation des Transreplikons. In Infiltrationsexperimenten mit Agrobakterien, die die Expression des AbMV Replikation-assoziiertem Proteins (Rep) und TrAP vermitteln, konnte gezeigt werden, dass die Mobilisierung des Transreplikons ausschließlich Rep-induziert ist. Während die Co-Expression von Rep und TrAP, genauso wie Agrobakterium-vermittelte Transfektion mit dem infektiösen AbMV DNA A Plasmid, die Mobilisierung des Transreplikons unterdrückt. Das gut charakterisierte Silencing-Suppressor Protein p19 des Cymbidium ringspot virus, eines nicht verwandten RNA Virus, neutralisierte diesen Effekt, so dass von einer siRNA-vermittelten Unterdrückung der Transreplikation ausgegangen werden konnte. Durch Darstellung der Topoisomere der viralen DNA konnte auf verschiedene Kondensierungszustände geminiviraler Minichromosomen geschlossen werden. Für AbMV konnte festgestellt werden, dass das Chromatin mit fortschreitender Infektionsdauer kondensierter und damit möglicherweise Transkriptions-inaktiver wird. Eine Überexpression von TrAP inhibierte diesen Effekt, was auf eine chromatinmodulierende Eigenschaft hinweist, während eine Funktion als Silencing-Suppressor eher unwahrscheinlich ist.