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Open Access
Biochemical investigation of the substrate specificity of protein methyltransferases and the identification of novel substrates
(2016) Kusevic, Denis; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)
Posttranslationale Proteinmodiﬁkationen (PTMs) sind wichtig, um verschiedene Proteinfunktionen, wie z. B. Lokalisation, Aktivität, Stabilität und Protein-Protein Interaktionen zu regulieren. In Proteinen können viele Aminosäuren methyliert werden, darunter auch Lysin, Arginin und Glutamin. Methylierungen sind auf vielen verschieden Protein zu ﬁnden, jedoch sind Histonproteine die bedeutendsten. Die Histonmethylierung beeinﬂusst die Chromatinstrukur und spielt eine große Rolle in der Regulation der Transkription. Die Enzyme, die für den Transfer von Methylgruppen auf die Proteine zuständig sind, werden Protein Methyltransferasen (PMTs) genannt. Sie sind sehr speziﬁsch und methylieren immer nur eine Art von Aminosäuren. Dabei zeigt die schnell steigende Anzahl an Berichten über die Methylierung von Proteinen, dass die Methylierung als posttranslationale Modiﬁkation in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewinnt. In dieser Doktorarbeit wurde die Substratspeziﬁtät dreier unterschiedlicher Protein Methyltransferasen untersucht, und zwar von HEMK2, einer Glutamin Methyltransferase, sowie von NSD2 und Clr4, zwei Protein Lysin Methyltransferasen (PKMTs). Die Glutamin Methyltransferase HEMK2 methyliert Q185 des Terminationsfaktors eRF1 (eukaryotic translation release factor 1), der für die Termination der Peptidsynthese und für die Hydrolyse der Polypeptidkette von der tRNA am Ribosom verantwortlich ist. Zur Bestimmung der Substratspeziﬁtät von HEMK2 wurde die Aminosäuresequenz von eRF1 als Vorlage verwendet und die erhaltenen Daten zeigen, dass das Substrat für eine Methylierung ein G-Q-X3-K Sequenzmotiv besitzen muss. Eine Suche nach dieser Sequenz in einer Proteindatenbank ergab, dass mehrere humane Proteine dieses Sequenzmotiv besitzen. Von diesen identiﬁzierten Substratkandidaten wurden 125 von HEMK2 auf Peptidebene methyliert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass von diesen 125 Kandidaten 16 auf Proteinebene methyliert werden. Zuletzt wurde eine Methylierung der „Chromodomain helicase DNA binding protein 5“ (CHD5) und „Nuclear protein in Testis“ (NUT) Proteine mit Hilfe eines glutaminspeziﬁschen Antikörpers in menschlichen HEK293 Zellen nachgewiesen. NSD2 ist ein Mitglied der „nuclear receptor SET domain-containing“ Enzymfamilie und dimethyliert Lysin K36 von Histon H3 und Lysin K44 von Histon H4. Es wurde gezeigt, dass eine abnormale Expression von NSD2 zu verschiedenen Arten von Krebs und dem Wolf-Hirschhorn Syndrom führen kann. Die Analyse der Substratspeziﬁtät von NSD2 zeigte, dass dieses Enzym die Aminosäuren G33 bis P38 von H3 erkennt. Dabei werden hydrophobe Aminosäuren an den Positionen -1 und +2 (das Ziellysin wird hierbei als Position 0 deﬁniert) bevorzugt. Mit Hilfe des Speziﬁtätsproﬁls von NSD2 wurden mehrere humane Proteine identiﬁziert, die dieses Sequenzmotiv enthalten. Von diesen identiﬁzierten Substratkandidaten wurden 45 durch NSD2 auf Peptidebene methyliert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass 3 Kandidaten (ATRX, FANCM und SET8) auf Proteinebene methyliert wurden und zusätzlich konnte die Methylierung von ATRX und FANCM durch NSD2 in HEK293 Zellen nachgewiesen werden. Da die Methylierungen einen erheblichen Einﬂuss auf die Eigenschaften und Funktionen von Proteinen besitzen, müssen weitere Experimente an den neuen Substraten von HEMK2 (CHD5 und NUT) und NSD2 (ATRX und FANCM) durchgeführt werden, um die Auswirkungen auf die biologischen Funktionen der Methylierung herauszuﬁnden. Abgesehen von den menschlichen Enzymen, wurden ähnliche Untersuchungen auch an der Histon Lysin Methyltransferase Clr4, einem SUV39H1-Homolog aus S. pombe, durchgeführt. Clr4 trimethyliert Lysin K9 des Histonproteins H3. Zur Bestimmung des Speziﬁtätsproﬁls von Clr4 wurde die Aminosäuresequenz von H3 (1 - 18) verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass Clr4 speziﬁsch die Aminosäuren der Positionen -1 bis +3 der Zielsequenz erkennt. Zusätzlich wurden 6 neue Peptidsubstrate aus S. pombe identiﬁzieren, die durch Clr4 methyliert wurden. Um die Detektion von Proteinmethylierungen weiter zu verbessern, wurde eine neue radioaktivitätsfreie, Mikrotiter-Untersuchungsmethode entwickelt, die natürlich vorkommende Lese-Domänen anstelle von methylspeziﬁschen Antikörpern zur Erkennung von Methylierungen auf Histonpeptiden verwendet. Es wurde gezeigt, dass diese Methode erfolgreich die Methyltransferaseaktivität bestimmen und für die Suche nach PKMT Inhibitoren verwendet werden kann.
Open Access
Globally altered epigenetic landscape and delayed osteogenic differentiation in H3.3-G34W-mutant giant cell tumor of bone
(2020) Lutsik, Pavlo; Baude, Annika; Mancarella, Daniela; Öz, Simin; Kühn, Alexander; Toth, Reka; Hey, Joschka; Toprak, Umut H.; Lim, Jinyeong; Nguyen, Viet Ha; Jiang, Chao; Mayakonda, Anand; Hartmann, Mark; Rosemann, Felix; Breuer, Kersten; Vonficht, Dominik; Grünschläger, Florian; Lee, Suman; Schuhmacher, Maren Kirstin; Kusevic, Denis; Jauch, Anna; Weichenhan, Dieter; Zustin, Jozef; Schlesner, Matthias; Haas, Simon; Park, Joo Hyun; Park, Yoon Jung; Oppermann, Udo; Jeltsch, Albert; Haller, Florian; Fellenberg, Jörg; Lindroth, Anders M.; Plass, Christoph
The neoplastic stromal cells of giant cell tumor of bone (GCTB) carry a mutation in H3F3A, leading to a mutant histone variant, H3.3-G34W, as a sole recurrent genetic alteration. We show that in patient-derived stromal cells H3.3-G34W is incorporated into the chromatin and associates with massive epigenetic alterations on the DNA methylation, chromatin accessibility and histone modification level, that can be partially recapitulated in an orthogonal cell line system by the introduction of H3.3-G34W. These epigenetic alterations affect mainly heterochromatic and bivalent regions and provide possible explanations for the genomic instability, as well as the osteolytic phenotype of GCTB. The mutation occurs in differentiating mesenchymal stem cells and associates with an impaired osteogenic differentiation. We propose that the observed epigenetic alterations reflect distinct differentiation stages of H3.3 WT and H3.3 MUT stromal cells and add to H3.3-G34W-associated changes.
Open Access
Investigation of the methylation of Numb by the SET8 protein lysine methyltransferase
(2015) Weirich, Sara; Kusevic, Denis; Kudithipudi, Srikanth; Jeltsch, Albert
It has been reported that the Numb protein is methylated at lysine 158 and 163 and that this methylation is introduced by the SET8 protein lysine methyltransferase [Dhami et al., (2013) Molecular Cell 50, 565-576]. We studied this methylation in vitro using peptide arrays and recombinant Numb protein as substrates. Numb peptides and protein were incubated with recombinant SET8 purified after expression in E. coli or human HEK293 cells. However, no methylation of Numb by SET8 was detectable. SET8 methylation of Histone H4 and p53 peptides and proteins, which were used as positive controls, was readily observed. While SET8 methylation of Numb in cells cannot be ruled out, based on our findings, more evidence is needed to Support this claim. It appears likely that another not yet identified PKMT is responsible for the reported methylation of Numb in cells.