Browsing by Author "Kusharyoto, Wien"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 1 of 1
  • Thumbnail Image
    ItemOpen Access
    Strukturelle Untersuchungen an Atrazin- und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-spezifischen Antikörperfragmenten mittels molecular modelling und ortspezifischer Mutagenese
    (2001) Kusharyoto, Wien; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
    In der vorliegenden Arbeit wurden die Bindungseigenschaften eines Atrazin-spezifischen Fab-Fragments K411B und eines 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D)-spezifischen Fab-Fragments Fab24D mittels molecular modelling und ortspezifischer Mutagenese untersucht. Auf der Grundlage der Sequenzhomologie mit bekannten Antikörperstrukturen und durch die Identifizierung der kanonischen Strukturklassen der CDR wurde jeweils ein Strukturmodell für das variable Fragment des Antikörpers entwickelt. Die Identifizierung der für die Bindung des Haptens verantwortlichen Aminosäurereste erfolgte mittels molekülmechanischen und -dynamischen Methoden und unter Verwendung des Kreuzreaktivitätsmusters des jeweiligen Antikörpers. Durch Mutationen bestimmter Aminosäurereste in der Bindungsstelle des jeweiligen Antikörpers konnten die Zuverlässigkeit der Strukturmodelle bestätigt werden. Im Falle des Atrazin-spezifischen Fab-Fragments K411B konnte eine fünffach höhere Affinität durch die Kombination der Punktmutationen GlnL89Glu, ValH37Ile und GluL3Val erreicht werden, wie die Messung mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz mit BIAcore ergab. Die höhere Affinität führte im direkten kompetitiven ELISA für Atrazin jedoch nicht zur Verbesserung der Sensitivität. Durch die Ausnutzung der Erhöhung der Affinität und der geringen Kreuzreaktivität der Mutanten zum Hapten 4-Amino-6-chloro-1,3,5-triazin-2-(6-aminohexansäure) konnte eine achtfache Verbesserung der Sensitivität des Atrazin-ELISAs erzielt werden. Die Reduzierung der Spacererkennung durch die Mutationen PheL32Leu und GlnL89Glu führte zu einer dreifachen Verbesserung der Sensitivität des Atrazin-ELISAs. Im Falle des 2,4-D-spezifischen Fab-Fragments ergaben die Mutationen HisL34Phe und HisL34Tyr eine Veränderung der Spezifität von 2,4-D nach 2,4,5-T, die jedoch mit einer deutlichen Abnahme der Affinität verbunden war.