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Durch Überexpression in der Hefe Pichia pastoris zu erhöhter Enantioselektivität : ein neues Kapitel in der Anwendung von Schweineleberesterase
(2001) Musidlowska, Anna; Lange, Stefan; Bornscheuer, Uwe Theo
Lipases and Esterases can be used as efficient biocatalysts for the preparation of a wide variety of optically pure compounds. Whereas a range of lipases - especially of microbial origin - are commercially available, only a few esterases can be obtained for the kinetic resolution of racemates or desymmetrization. In the majority of publications, pig liver esterase (PLE) is used, which is isolated from pig liver by extraction. Although it could be demonstrated, that this preparation can convert a broad range of compounds at partially very high stereoselectivity, its application is encountered with a number of disadvantages.
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Etablierung von neuen Methoden zur Herstellung rekombinanter Antikörper und zur spezifischen Selektion von Antikörpervarianten im hohen Durchsatz
(2002) Lange, Stefan; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst rekombinante herbizidspezifische Antikörperfragmente (single chain Fragmente und Fab Fragmente) in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris produziert. Dies gelang jeweils durch genomische Integration der codierenden Gene. Im Fall des atrazinspezifischen Fabs K411B wurden hierfür mehrere Vektoren hergestellt, die jeweils die Gene beider Ketten als Fusion mit der a-Faktor-Signalsequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors enthielten. Somit konnten nach Transformation eines einzigen Vektors in Pichia beide Antikörperketten exprimiert und ins Medium sekretiert werden. Es zeigte sich, daß Klone mit beiden Genen unter Kontrolle des methanolinduzierbaren AOX1 Promotors größere Mengen Fab exprimierten, als solche mit den Antikörpergenen unter Kontrolle des konstitutiven GAPDH-Promotors. Durch fed-batch Kultivierung im 5l Bioreaktor konnten schließlich 40 mg l-1 Fab exprimiert werden. Wie sich durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte, bildeten ca. 30 % der schweren und leichten Ketten komplette Fab Fragmente. Auch im Falle des scFv K411B konnte mit Klonen, die das scFv-Gen als Fusion mit dem a-Faktor unter Kontrolle des AOX1-Promotors genomisch integriert trugen deutlich mehr exprimiert werden. Die Bindungseigenschaften des scFv und des Fab K411B wurden mit einem direkten, kompetitiven ELISA bestimmt: Wie erwartet zeigten beide Antikörperfragmente Testmittelpunkte von ca. 3 µg l-1. Dieser lag damit jedoch um ca. eine Größenordnung höher, als der mit dem parentalen monoklonalen Antikörper K4E7 gemessene Wert von ca. 0,2 µg l-1. Die Kreuzreaktivitäten der verschiedenen rekombinanten Antikörper stimmten jedoch nahezu mit denen des mAk überein. Die Entfernung mehrerer Restriktionsschnittstellen in dem für die Expression des Fab K411B hergestellten Expressionsvektor ermöglichte dessen Verwendung zur Herstellung von Fab Fragmenten beliebiger Spezifität durch einfachen Austausch der nun durch singuläre Schnittstellen begrenzten variablen Domänen. Dies wurde durch Expression eines 2,4-D-spezifischen Fabs validiert. Obwohl die exprimierte Menge deutlich geringer, als die des Fab K411B war, konnte mittels ELISA eine sigmoidale Bindungskurve zur Bestimmung von 2,4-D erstellt werden, aus der sich ein Testmittelpunkt von ca. 10 µg l-1 ergab. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neben dem ELISA weitere Methoden zur Messung der Bindungseigenschaften von Antikörpern etabliert und bezüglich ihrer Eignung zum Screening von Antikörperbibliotheken in hohem Durchsatz getestet: Zunächst wurde ein auf Fluoreszenzpolarisation beruhender homogener, kompetitiver Assay entwickelt. Mit einem Testmittelpunkt von ca. 90 µg l-1 bei der Bestimmung von Atrazin wäre für Anwendungen in der Umweltanalytik jedoch eine Optimierung hinsichtlich einer verbesserten Sensitivität notwendig. Aufgrund seiner im Vergleich zum ELISA sehr schnellen Durchführbarkeit, wäre der Einsatz als Schnelltest im mittleren Durchsatz geeignet und weniger für ein Screening im hohen Durchsatz, da die Ergebnisse im Vergleich zum ELISA weniger genau und reproduzierbar waren. Zum Screening von Antikörperbibliotheken und zur Selektion von Varianten mit bestimmten Bindungseigenschaften im hohen Durchsatz, wie es für evolutive Methoden erforderlich ist, wurde ein Hefeoberflächenexpressionssystem etabliert. Diese mit dem Phagen-Display verwandte Methode ist im Gegensatz zum ELISA und zum Fluoreszenzpolarisationstest vom Mikrotiterplattenformat unabhängig, da die Bestimmung der Bindungseigenschaften sowie die Selektion von Varianten mit dem Durchflußcytometer erfolgt: Durch Fusion der Gene der scFv's mit dem Gen einer Domäne des Agglutininrezeptors gelang nach Transformation des Fusionsgenes die Expression und Präsentation des daraus resultierenden funktionellen Fusionsproteins auf der Hefeoberfläche. Die damit erreichte Kopplung von Geno- und Phänotyp erlaubt durch Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antigenen und/oder Epitop-spezifischen Antikörpern und nachfolgender Analyse und Sortierung am Durchflußcytometer das Screening und die Selektion von Hefezellen, die Antikörper mit speziellen Bindungseigenschaften exprimieren. Die erfolgreiche funktionelle Expression der verschiedenen scFv's auf der Hefeoberfläche wurde durch Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Laserscanning-Mikroskopie sowie FACS-Messungen überprüft und bestätigt. Eine Vereinfachung der Screeningmethode wurde durch Expression des scFv-EGFP auf der Oberfläche der Zellen erreicht: Damit kann auf die für die Bestimmung der Oberflächenexpressionsmenge notwendige Markierung der scFv's mit Epitop-spezifischen fluorezenzmarkierten Antikörpern verzichtet werden, da die Fluoreszenz des EGFP-Anteils direkt mit der Menge des exprimierten Fusionsproteins korreliert.
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High-yield expression of the recombinant, atrazine-specific Fab fragment K411B by the methylotrophic yeast Pichia pastoris
(2001) Lange, Stefan; Schmitt, Jutta; Schmid, Rolf D.
In this report, we describe the high-yield secretory expression (~ 40 mg l-1) of pure, atrazine-specific Fab fragments (K411B) from P. pastoris that was achieved by co-integration of the genes encoding the heavy and light chains (both under the control of the alcohol oxidase promoter) into the genome of the yeast cells. Antibody-expressing clones were selected by SDS-PAGE and ELISA and fed-batch fermentations were carried out in a 5 l scale. Both chains of the Fab were successfully expressed upon methanol induction and almost no other proteins were secreted into the media. Approximately 30 % of the two chains formed the active Fab fragment containing the intermolecular disulphide bond, as determined by Western blot analysis under non-reducing conditions. Crude culture supernatant was used to study the binding properties of the Fab fragment toward different s-triazines by means of competitive ELISA: the IC50 value for the detection of atrazine was determined from the standard curve as 3 µg l-1, which is one magnitude higher than the value obtained with the parental mAb K4E7 but equals that obtained when the same Fab fragment was expressed in E. coli cells. In addition, the cross-reactivity pattern of the Fab from Pichia is comparable to that of E. coli and the parental mAb K4E7.
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Identification of factors impeding the production of a single-chain antibody fragment in Escherichia coli by comparing in vivo and in vitro expression
(2003) Ölschläger, Peter; Lange, Stefan; Schmitt, Jutta; Siemann-Herzberg, Martin; Reuss, Matthias; Schmid, Rolf D.
In order to produce the atrazine-specific scFv K411B, it was expressed in either the cytoplasm or the periplasm of Escherichia coli BL21(DE3). For periplasmic production, the scFv was N-terminally fused to the pelB leader, whereas the unfused variant resulted in cytoplasmic expression. The extent of protein accumulation differed significantly: The expression level of the scFv with leader was 2.3 times higher than that of the protein without leader. To further investigate this, the respective translation profiles were generated by coupled in vitro transcription/translation assays and gave according results. Periplasmic expression resulted in only 10% correctly folded scFv. The same percentage was obtained when the scFv was expressed in vitro, indicating that the oxidizing environment of the periplasm did not increase proper folding. Thus, the data obtained in vitro confirmed the findings observed in vivo and suggested that the discrepancy in expression levels was due to different translation efficiencies. However, the in vivo production of the scFv with EGFP fused C-terminally (scFv-EGFP) was only successful in the cytoplasm, although in vitro the expression with and without the leader rendered the same production profile. This indicated that neither the translation efficiency nor the solubility but other factors impeded periplasmic expression of the fusion protein.
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Recombinant production of human microsomal cytochrome P450 2D6 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
(2005) Dietrich, Matthias; Grundmann, Lisa; Kurr, Katja; Valinotto, Laura; Richter, Tanja; Schmid, Rolf D.; Lange, Stefan
Microsomal cytochrome P450 monooxygenases of the groups 1 – 3 are mainly expressed in liver and play a crucial role in phase 1 reactions of the xenobiotics metabolism. The cDNAs encoding human CYP2D6 and human NADPH-P450 oxidoreductase (CPR) were transformed into the methylotrophic yeast Pichia pastoris and expressed under control of the methanol inducible AOX1 promotor. The determined molecular weights of the recombinant CYP2D6 and CPR closely matched the calculated values of 55.8 and 76.6 kDa. CPR activity was detected by conversion of cytochrome c using isolated microsomes. Nearly all the recombinant CYP is composed of the active holo-enzyme as confirmed by reduced CO-difference spectra which showed a single peak at 450 nm. Only by co-expression of human CPR and CYP, CYP2D6 activity was obtained. Microsomes containing human CPR and CYP2D6 converted different substrates, such as 3-cyano-7-ethoxycoumarin, parathion, and dextrometorphan. The kinetic parameters of the dextrometorphan conversion closely matched those of CYP2D6 from other recombinant expression systems as well as from human microsomes. The endogenous NADPH-P450 oxidoreductase of Pichia pastoris seems to be incompatible with human CYP2D6, as expression of CYP2D6 without human CPR did not result in any CYP-activity. These recombinant strains provide a novel, easy-to-handle and cheap source for the biochemical characterization of single microsomal cytochromes as well as their allelic variants.
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Screening, cloning and biochemical characterisation of novel esterases from bacillus sp. associated with the marine sponge aplysina aerophoba
(2005) Karpushova, Anna Alexandrovna; Brümmer, Franz; Lange, Stefan; Schmid, Rolf D.
Two novel esterases (EstB1 and EstB2) were isolated from a genomic library of Bacillus sp. associated with the marine sponge Aplysina aerophoba. EstB1 shows low identity (26-44 %)with the published hydrolases of the genus Bacillus, whereas EstB2 shows high identity (73-74 %) with the carboxylesterases from B. cereus and B. anthracis. Both esterases were efficiently expressed in Escherichia coli under the control of T7 promoter using the vector pET-22b(+). Recombinant EstB1 was purified in a single step to electrophoretic homogeneity by IMAC. A method for the refolding of inclusion bodies formed by the recombinant EstB2 was established to obtain active enzyme. Substrate specificity of the two enzymes towards pnitrophenyl and methyl esters and the respective kinetic parameters Km and Vmax were determined. The temperature optima of EstB1 and EstB2 were determined to be in the range of 30-50°C and 20-35°C, respectively. The pH optima were found to be in the range of 6.5-7.5 and 6.5-8.0, respectively. Both enzymes showed the highest stability in up to 50 % (v/v) DMSO followed by methanol, ethanol and 2-propanol. The influence of high NaCl and KCl concentrations was tested. The inhibition effect of 10-50 mM Zn2+ and 50 mM Mg2+ and Ca2+ ions was observed for both esterases. 1-5 mM PMSF deactivated the enzymes, whereas β-mercaptoethanol, DTT and EDTA had no effect on the enzymes activity.
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Three-step process for efficient solar cells with boron-doped passivated contacts
(2024) Sharbaf Kalaghichi, Saman; Hoß, Jan; Linke, Jonathan; Lange, Stefan; Werner, Jürgen H.
Crystalline silicon (c-Si) solar cells with passivation stacks consisting of a polycrystalline silicon (poly-Si) layer and a thin interfacial silicon dioxide (SiO2) layer show high conversion efficiencies. Since the poly-Si layer in this structure acts as a carrier transport layer, high doping of the poly-Si layer is crucial for high conductivity and the efficient transport of charge carriers from the bulk to a metal contact. In this respect, conventional furnace-based high-temperature doping methods are limited by the solid solubility of the dopants in silicon. This limitation particularly affects p-type doping using boron. Previously, we showed that laser activation overcomes this limitation by melting the poly-Si layer, resulting in an active concentration beyond the solubility limit after crystallization. High electrically active boron concentrations ensure low contact resistivity at the (contact) metal/semiconductor interface and allow for the maskless patterning of the poly-Si layer by providing an etch-stop layer in an alkaline solution. However, the high doping concentration degrades during long high-temperature annealing steps. Here, we performed a test of the stability of such a high doping concentration under thermal stress. The active boron concentration shows only a minor reduction during SiNx:H deposition at a moderate temperature and a fast-firing step at a high temperature and with a short exposure time. However, for an annealing time 𝑡anneal = 30 min and an annealing temperature 600 °C ≤ 𝑇anneal ≤ 1000 °C, the high conductivity is significantly reduced, whereas a high passivation quality requires annealing in this range. We resolve this dilemma by introducing a second, healing laser reactivation step, which re-establishes the original high conductivity of the boron-doped poly-Si and does not degrade the passivation. After a thermal annealing temperature 𝑇anneal = 985 °C, the reactivated layers show high sheet conductance (Gsh) with Gsh = 24 mS sq and high passivation quality, with the implied open-circuit voltage (iVOC) reaching iVOC = 715 mV. Therefore, our novel three-step process consisting of laser activation, thermal annealing, and laser reactivation/healing is suitable for fabricating highly efficient solar cells with p++-poly-Si/SiO2 contact passivation layers.