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Die Bedeutung der H-Untereinheit des Reaktionszentrums bei der Assemblierung des Lichtsammelkomplexes LH1 in Rhodospirillum rubrum
(2005) Lupo, Domenico; Ghosh, Robin (Prof. Dr.)
Das photosynthetische Bakterium Rhodospirillum rubrum gehört zur Familie der Nichtschwefelpurpurbakterien (Rhodospirillaceae). Es zeichnet sich durch seinen vielfältigen Stoffwechsel aus, darunter die Fähigkeit fakultativ photosynthetisch zu wachsen. Dabei vollzieht es eine sogenannte anaerobe, anoxygene Photosynthese; dazu dient der photosynthetische Apparat (PSA). Dieser PSA befindet sich in spezialisierten Membranen, die aus der inneren Membran des Bakteriums durch Einstülpung hervorgehen und intracytoplasmatische Membranen (ICM) genannt werden. Die Produktion der ICM unterliegt der Regulation durch ein Netzwerk verschiedener Komponenten, die hauptsächlich auf den Sauerstoffpartialdruck ansprechen. Sobald dieser unter den Schwellenwert von 1% sinkt werden sogar im Dunkeln ICM produziert. Die Hauptkomponente des PSA ist die photosyn-thetische Einheit (PSU). Sie besteht aus einem Lichtsammelkomplex LH1 und dem photo-synthetischen Reaktionszentrum RC. Der LH1 aus R. rubrum besteht aus 16 Heterodimeren, wobei jedes Heterodimere aus zwei kleinen Polypeptiden a und b aufgebaut ist, an die zwei Bakteriochlorophyllmoleküle und ein Carotinoid gebunden sind. Die LH1 bilden, wie Strukturanalysen aus R. rubrum bei mittlerer Auflösung ergaben, eine geschlossene Struktur um das RC aus. Vom RC aus R. rubrum gibt es keine Strukturdaten, aber es sind Strukturen aus verwandten Arten vorhanden, die durch Röntgenbeugungsanalysen an RC-Kristallen erhalten worden waren. Diese RC-Strukturen zeigen alle den gleichen Aufbau: Sie bestehen, wie schon früher biochemisch festgestellt, aus drei Untereinheiten (H, M und L). Die Konfor-mation der Heterotrimeren ist identisch und bestätigt frühere Untersuchungen, dass nur die M- und die L-Untereinheit die photosynthetisch relevanten Cofaktoren binden: Vier Bakterio-chlorophyllmoleküle, zwei Bakteriophaeophytine, ein Carotinoid, zwei Ubichinonmoleküle und ein Eisenatom. Die Funktion der H-Untereinheit dagegen wurde später durch biochemische, molekularbiologische und strukturbiologische Methoden näher charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten für die H-Untereinheit eine wichtige Rolle beim Zusammenbau des RC bzw. der PSU, sowie eine Beteiligung am Primärprozess der Photosynthese: Das Fehlen der H-Untereinheit äußerte sich in der Abwesenheit funktioneller RCs, der Unfähigkeit zur Photosynthese und drastisch verminderten LH1- und ICM-Mengen. Dabei waren aber in einigen Studien, darunter die an R. rubrum, nicht nur das Gen für die H-Untereinheit (puhA) deletiert, sondern auch flankierende Gensequenzen entfernt worden. In neueren Arbeiten wurde der mehrteilige Aufbau der H-Untereinheit untersucht und den einzelnen Domänen Funktionen zugeordnet. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Projekte mit folgenden Zielsetzungen bearbeitet: – Die genauere Charakterisierung von H-Untereinheitsmutanten aus R. rubrum, die durch einen präzisen genetischen Eingriff hergestellt wurden, und deren Rückführung in den ursprünglichen Elternstatus, mit dem Ziel ein Deletions/Komplementations-system zu etablieren. – Darauf aufbauend sollten durch zielgerichteter Mutagenese an der H-Untereinheit Domänen definiert und deren Funktion untersucht werden. Das Ziel war die minimale Komponente der H-Untereinheit zu definieren, die in den oben genannten Mutanten den Elternstatus wiederherstellte. – Das Protokoll zur Isolierung und Aufreinigung der PSU aus R. rubrum sollte modifiziert und optimiert werden. Angestrebt war eine einfachere und kostengünstige-re Methode, um große Mengen an reiner PSU zu erhalten. – Die aufgereinigte PSU aus R. rubrum sollte biophysikalisch, biochemisch und strukturbiologisch untersucht werden, um die Geometrie des LH1 in der PSU zu klären, die Komponenten der isolierten PSU zu identifizieren und die PSU zu kristallisieren. Die genaue Charakterisierung der Mutanten der H-Untereinheit zeigte, dass die durch die Abwesenheit der H-Untereinheit verursachte Reduktion der LH1- und ICM-Mengen aufgehoben werden konnte. Erreicht wurde dies durch die Kultivierung der H-defizienten Stämme in Medien verschiedener Zusammensetzung. Das Deletions/Komplementations-system konnte etabliert werden, indem der ursprüngliche Elternstatus durch ein Plasmid wiederhergestellt wurde, welches das Gen für die H-Untereinheit besaß. Von diesem Plasmid ausgehend, konnte durch ein molekularbiologisches Design die H-Untereinheit erfolgreich in zwei Domänen getrennt werden. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die getrennten, aber gemeinsam exprimierten Domänen die Funktion eines intakten H-Proteins beibehalten und somit in der Lage waren, den ursprünglichen Elternstatus in H-defizienten Stämmen hervorzurufen. Durch den einzigartigen Befund, dass jede Domäne für sich, selbständig exprimiert, in der Lage war, RC-Komplexe zu bilden und photosynthetisches Wachstum zu ermöglichen, konnten gleich zwei verschiedene minimale Komponenten definiert werden. Die genetischen Konstrukte, sowie die erhaltenen Expressionsstämme stellen die Grundlage für zukünftige Projekte dar. In diesen soll eine Beteiligung der H-Untereinheit am Regulationsnetzwerk untersucht bzw. dessen Einfluss auf die Sauerstoffempfindlichkeit der generierten Stämme systembiologisch geklärt werden. Das alte Protokoll zur Isolierung und Aufreinigung der PSU aus R. rubrum konnte in seinem Ablauf deutlich vereinfacht werden. Durch die Wahl eines geeigneten Detergenz bzw. des Säulenmaterials für die Chromatographie wurde eine wesentliche Kosteneinsparung erreicht. Mit dem neuentwickelten Protokoll können bei gleicher Ansatzgröße, im Vergleich zum alten, zehnfach höhere Mengen an PSU isoliert werden. Das Absorptionsspektrum dieser PSU-Präparation entsprach dem unbehandelter ICM und die biochemische Analyse mittels Gelelektrophorese zeigte das gleiche Profil wie PSU-Präparationen nach dem alten Protokoll. Die in den PSU enthaltenen Proteine wurden durch Aminosäuresequenzierung mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert. Dabei handelt es sich um die erste Studie, in der Komponenten der isolierten PSU mit dieser Methode charakterisiert werden. Zusätzlich zu den Komponenten des RC und LH1 wurde ein Protein der äußeren Membran, Porin 41, in der PSU-Präparation gefunden, welches in intensiver Wechselwirkung mit der PSU steht. In zukünftigen Projekten soll geklärt werden, ob dieses Porin ein echter Bestandteil der PSU ist oder aber ein Reinigungsartefakt; wobei im ersten Fall natürlich die Frage nach der Funktion des Porins zu beantworten sein wird. Zur Klärung der Geometrie des LH1 in der PSU wurden Einzelmolekülspektroskopiemessungen durchgeführt und ergaben einen eindeutig zirkular-symmetrischen Aufbau des LH1 um das RC. Dieser Befund galt für detergenz-solubilisierte PSU, aber auch für PSU, die erstmals in Lipidvesikeln rekonstituiert worden waren. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu jenen anderer Arbeitsgruppen, die alle elliptisch deformierte LH1-Komplexe in ihren PSU-Präparationen fanden. Die zweidimensionale Kristallisation zur Aufklärung der PSU-Struktur wurde soweit optimiert, dass Kristalle in reproduzierbarer Qualität erhalten wurden. Deren Auflösung lag im mittleren Bereich und ist weiter zu verbessern. Auch die dreidimensionale Kristallisation der PSU kann nunmehr in Angriff genommen werden, da die benötigte Proteinmenge mit dem neuen Protokoll erreicht wird. Mit dem neuentwickelten Reinigungsverfahren konnte ein Protokoll etabliert werden, um PSU aus verschiedenen R. rubrum Stämmen routinemäßig zu isolieren. Diese können nicht nur bezüglich ihrer Zusammensetzung, Konformation oder Struktur untersucht, sondern auch zur Aufklärung des Energietransfermechanismus weiter analysiert werden.