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    ItemOpen Access
    Array-basierte Identifizierung humanpathogener Schimmel- und Hefepilze für die klinische Diagnostik
    (2015) Mayer, Linda S. L.; Rupp, Steffen (apl. Prof. Dr.)
    Die Zahl der invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten nahm in den letzten Jahren stetig zu. Betroffen sind u.a. Frühgeborene, Krebs- und AIDS-Patienten, Transplantierte sowie Mukoviszidose-Patienten. Zeitintensive Diagnostikmethoden in den klinischen Laboratorien können bei invasiven fungalen Infektionen zu hohen Mortalitätsraten der betroffenen Patienten führen. Diese Methoden beruhen auf Kultivierungen der Patientenproben sowie morphologischen und physiologischen Tests. Empirische Therapien ohne klare Diagnose bergen neben Unwirksamkeiten und Resistenzentwicklungen auch die Gefahr massiver Nebenwirkungen, die den Zustand der Patienten verschlechtern können. Bei fungalen Infektionen kann die Kultivierungszeit der Patientenproben bis zu einem eindeutig positiven oder negativen Ergebnis, Tage und sogar Wochen in Anspruch nehmen. Durch eine zeitnahe und adäquate Medikation infolge einer schnellen und speziesspezifischen Identifizierung direkt aus der Patientenprobe könnte die Lebenserwartung der Patienten erhöht werden. Dies bedarf einer sensitiven Identifizierungsmethode, die selbst sehr geringe Zellzahlen auf Spezieseben nachzuweisen vermag. In dieser Arbeit wurde ein PCR-Array-System basierend auf konservierten und variablen Sequenzen der Internal transcribed spacer Region des ribosomalen Clusters für den Nachweis humanpathogener Pilze etabliert. Durch den Einsatz panfungaler Primer in der etablierten ITS-Nested-PCR konnte eine Mindestmenge von zehn fungalen DNA-Molekülen bei hohem humanem DNA-Hintergrund zuverlässig amplifiziert werden. Von insgesamt 566 entwickelten DNA-Oligonukleotid-Sonden wurden 96 ITS-Sonden ausgewählt. Diese erlaubten eine simultane Überprüfung der amplifizierten ITS-Region auf 56 humanpathogene fungale Spezies. Das etablierte finale PCR-Array-System wurde mit fungaler Referenz-DNA bei humanem DNA-Hintergrund evaluiert. Bei 64 % der hybridisierten Spezies waren ausschließlich Signale auf den zugehörigen 30 Antisense-Sonden für diese Spezies zu verzeichnen. 36% der hybridisierten Spezies führten neben speziesspezifischen Signalen zudem zu Signalen auf Sonden, die nicht der hybridisierten Spezies zuzuordnen waren. Allerdings wiesen die unspezifischen Sondensignale hauptsächlich Intensitäten nahe des Detektionsschwellenwertes auf. Die statistische Bewertung des PCR-Array-Systems wies eine Richtig-Positiv-Rate von 100 % und eine Richtig-Negativ-Rate von 99 % für Einzelspezies-Hybridisierungen auf. Durch eine Zwei-Sonden-Diskriminierung, die bei monomikrobiellen Infektionen herangezogen werden könnte, ist bei diesen Spezies jedoch eine eindeutige Diskriminierung möglich. Die Evaluierung des Systems mit DNA aus Trachealsekreten und Bronchoalveolären Lavages zeigte, dass diese Unspezifitäten Spezies betraf, die für das untersuchte Probenmaterial klinisch weniger relevant waren wie bspw. Dermatophyten. Klinisch für die untersuchten Probenmaterialen relevantere Spezies wie Candida albicans und Nicht-albicans Candida Spezies konnten anhand spezifischer Sonden eindeutig identifiziert werden, wobei im Fall von Nicht-albicans Candida Spezies eine spezifischere Klassifizierung möglich war, als durch in der klinischen Diagnostik aktuell angewandte mikrobiologische Methoden. Bei 102 Patientenproben - Trachealsekreten und Bronchoalveolären Lavages - stimmte das Ergebnis des PCR-Array-Systems mit den mikrobiologische Befunden überein. Für 23 Proben konnte der mikrobiologische Befund durch die Ergebnisse des Systems erweitert werden. Bei weiteren 23 Proben wurden, mittels des entwickelten PCR-Array-Systems, weniger Spezies als durch mikrobiologische Methoden identifiziert. Lediglich bei drei Proben wurden komplett abweichende Array-Befunde erzielt.Beginnend mit der DNA-Isolierung der Patientenproben ist durch das in dieser Arbeit etablierte PCR-Array-System eine speziesspezifische Identifizierung und adäquate Medikation der Patienten innerhalb weniger Stunden realisierbar und würde zu einer erhöhten Überlebenschance dieser beitragen.