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Termination der Mitose: die Rolle der Phosphatase Cdc14 beim M/G1-Übergang in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
(2002) Neutzner, Albert; Seufert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Hauptregulatoren des eukaryotischen Zellteilungszyklus sind die zyklinabhängigen Kinasen (CDKs). Die koordinierte Aktivierung und Inaktivierung dieser Kinasen ermöglicht der Zelle das Voranschreiten im Teilungszyklus. Die Regulation der zyklinabhängigen Kinasen erfolgt im wesentlichen auf zwei Wegen. Zum einen fluktuieren die Mengen der positivregulatorsichen Zyklin durch zellzyklusabhängige Transkription und Degradation. Zum anderen werden die CDKs durch die Bindung von Inhibitoren an die Zyklin-CDK Komplexe inaktivert. Ein wichtiger Schritt im Zellteilungszyklus ist die Beendigung der Mitose und der damit verbundene Übergang in die nächste G1 Phase. Für diesen Vorgang ist die vollständige Inaktivierung aller zyklinabhängigen Kinasen essentiell. Ein Signaltransduktionsnetzwerk - das mitotic exit network MEN - reguliert diesen Prozess. Komponenten des MEN sind neben anderen die Kinasen Cdc15 und Cdc5 sowie die Phosphatase Cdc14. Haupteffektor dieses Signaltransduktionsnetzwerkes ist Cdc14. Diese Phosphatase wirkt antagonistisch zur zyklinabhängigen Kinase und dephosphoryliert viele Substrate der CDK. Die Phosphatase Cdc14 erlaubt somit den Zellen den Übertritt in den nächsten Zellzyklus. Ziel der Arbeit war es, die Aufgaben und die Regulation der Phosphatase Cdc14 zu untersuchen. Es wurde gefunden, dass Cdc14 ein genereller Aktivator der Proteindegradation am Ende der Mitose ist. Diese wird durch den Ubiquitinligasekomplex APC (anaphase promoting complex) vermittelt. Erhöhte Mengen an Cdc14 führen zum Abbau der Zykline Clb2, Clb3 und Clb5. Verantwortlich dafür ist die Cdc14-abhängige Dephosphorylierung des APC-Substratspezifitätsfaktor Hct1. Cdc14 ist hier der Gegenspieler der zyklinabhängigen Kinase, die Hct1 durch Phosphorylierung inaktiv hält. Cdc14 ist somit ein geschwindigkeitsbestimmender Faktor für die Inaktivierung der mitotischen CDKs am Ende der Mitose durch Proteolyse der positiv regulatorischen Zykline. Weiterhin beeinflusst Cdc14 einen zweiten Weg zur Inaktivierung der zyklinabhängigen Kinase am Ende der Mitose. Cdc14 aktiviert den Inhibitor zyklinabhängiger Kinasen Sic1 sowohl transkriptionell als auch posttranslational. Ein weiteres Substrat für die Phosphatase Cdc14 ist die MEN-Kinase Cdc15. Cdc15 ist Teil des MEN und selbst an der Aktivierung von Cdc14 beteiligt. Aktiviertes Cdc14 seinerseits dephosphoryliert Cdc15 und beeinflusst dadurch dessen Lokalisierung an den Spindelpolen. Die Spindelpollokalisierung von Cdc15 ist wichtig für den korrekten Ablauf der Zytokinese. Cdc14 ist somit ebenso wie viele andere MEN-Komponenten auch an der Regulation der Trennung von Mutter- und Tochterzelle beteiligt. Neben der Untersuchung der Aufgaben von Cdc14 war auch die Regulation von Cdc14 selbst ein Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zuerst wurde die Möglichkeit der Regulation von Cdc14 durch die zyklinabhängige Kinase untersucht. Viele Regulatoren des Zellteilungszyklus stehen unter direkter Kontrolle der CDK. Es wurde gefunden, dass Cdc14 ein in vitro Substrat für die zyklinabhängige Kinase ist. Die Entfernung aller potentiellen Phosphorylierungsstellen in Cdc14 für die zyklinabhängige Kinase ergab, dass unter Umständen die Phosphorylierung an zwei Positionen im nicht essentiellen C-Terminus von Cdc14 zu einer Aktivierung von Cdc14 beitragen kann. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass die Polokinase Cdc5 die Aktivierung von Cdc14 bewirkt. Nach einem gängigen Modell wird die Aktivität von Cdc14 durch seine Lokalisierung im Nucleolus reguliert. Die Phosphatase wird dort von ihrem Inhibitor Net1 während der meisten Zeit des Teilungszyklus verankert und inaktiv gehalten. Erst zu Beginn der Anaphase wird Cdc14 aus dem Nucleolus freigesetzt und dadurch aktiviert. Es wurde gefunden, dass hohe Mengen an Cdc5 zur Freisetzung von Cdc14 aus dem Nucleolus und zum Verlust der Interaktion mit dem Inhibitor Net1 führen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Cdc14 und sein Inhibitor Net1 während der Anaphase phosphoryliert werden. Die weitere Untersuchung ergab, dass beide Proteine Substrate für Cdc5 in vitro sind und ihre Phosphorylierung in vivo von funktioneller Polokinase abhängt. Cdc5 ist folglich ein Aktivator der CDK-antagonistischen Phosphatase Cdc14. Aufgrund der geschilderten Ergebnisse und der Literaturdaten wird vorgeschlagen, dass Cdc14 durch Cdc5-vermittelte Phosphorylierung und zusätzlich mit Hilfe anderer Komponenten des MEN aktiviert wird. Dies führt auf zwei Wegen zur Beendigung der Mitose. Zum einen aktiviert Cdc14 den APC durch Dephosphorylierung von Hct1 und löst somit die Degradation mitotischer Zykline aus. Zum anderen stabilisiert Cdc14 den Inhibitor Sic1 und inaktiviert dadurch die zyklinabhängige Kinase. Die Aktivierung von Cdc14 ist demnach der geschwindigkeitsbestimmende Schritt beim Übergang von der M Phase in den nächsten Teilungszyklus.