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Open Access
Regulatoren des Zellteilungszyklus der Hefe Saccharomyces cerevisiae: die Polo-Kinase Cdc5 und der Ubiquitinierungsfaktor Hct1
(2003) Neutzner, Melanie; Seufert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Ein Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Regulation der Cdc5-Aktivität durch zyklinabhängige Kinasen. Cdc5 besitzt fünf Konsensusstellen für Phosphorylierung durch CDKs. Durch ortsspezifische Mutagenese und in vitro Kinaseassays konnte gezeigt werden, dass Cdc5 tatsächlich ein Substrat für Komplexe aus Cdc28 mit B-Typ Zyklinen ist. Es ergaben sich weiterhin Hinweise darauf, dass die Phosphorylierung von Cdc5 durch CDK positiv auf die Cdc5-Kinaseaktivität wirkt. Zudem zeigt Cdc5 eine intermolekulare Autophosphorylierung. Der Austausch der dritten Cdc28-Konsensusstelle zu einer nicht-phosphorylierbaren Aminosäure hat einen kompletten Funktionsverlust des resultierenden Proteins zur Folge. Es ist allerdings nicht geklärt, ob diese Stelle in vivo tatsächlich phosphoryliert wird, oder ob sie beispielsweise aus strukturellen Gründen wichtig ist für die Enzymaktivität von Cdc5. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Regulation des APC-Spezifitätsfaktors Hct1. Hct1 vermittelt am Ende der Mitose die ubiquitinabhängige Degradation von Clb2, indem es dieses bindet und an den APC rekrutiert. Der APC ist eine multimere Ubiquitinligase und vermittelt die Polyubiquitinierung seiner Substrate. Die Bindung von Hct1 an den APC wird von zyklinabhängiger Kinase negativ reguliert. Hct1 besitzt elf Konsensusstellen für eine Phosphorylierung durch Zyklin-Cdc28-Komplexe. Ein Derivat, in dem alle elf Stellen nicht mehr phosphorylierbar sind, ist hyperaktiv. Es sollte nun im Detail geklärt werden, welchen Beitrag die einzelnen Konsensusstellen zur Inaktivierung von Hct1 leisten. Untersucht wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach Überproduktion verschiedener Hct1-Derivate und deren Fähigkeit zur Degradation von Clb2. Zudem wurde das Laufverhalten der verschiedenen Proteine im Western Blot untersucht. Es ergab sich, dass keine der untersuchten Stellen alleine eine vollständige Inaktivierung von Hct1 bewirken kann. Es konnten allerdings Positionen identifiziert werden, die einen stärkeren Einfluss auf die Hct1-Aktivität haben als andere. Besonders die vier Konsensusstellen im N-Terminus von Hct1 scheinen effizient phosphoryliert zu werden. Aber auch Stellen, die für sich alleine keinen Effekt auf die Hct1-Aktivität haben, bewirken in Kombination mit anderen Positionen eine Inhibierung von Hct1. Hct1 ist aber nicht nur ein Substrat für CDK, sondern auch für Cdc5-Kinase. Die Überproduktion von Cdc5 bewirkt eine Hyperphosphorylierung von Hct1, die von den ersten vier Cdc28-Konsensusstellen in Hct1 abhängig ist. Zudem interagiert Cdc5 präferentiell mit phosphorylierten Formen von Hct1. In in vitro Kinaseassays ist unphosphoryliertes Hct1 ein sehr schlechtes Substrat für Cdc5. Liegt Hct1 allerdings nach Behandlung mit zyklinabhängiger Kinase in phosphorylierter Form vor, wird es ein deutlich besseres Substrat für Cdc5. Diese Ergebnisse belegen, dass beide Gruppen mitotischer Kinasen, zyklinabhägige Kinasen und Polo-Kinasen, bei der Regulation von Hct1 kooperieren. Weiterhin konnten in dieser Arbeit neue Interaktionspartner von Cdc5 identifiziert werden. So interagiert Cdc5 mit dem Anaphaseinhibitor Pds1. Pds1 wird am Metaphase/Anaphase-Übergang APC-abhängig degradiert. Dieser Prozess ist abhängig von Cdc20, neben Hct1 ein weiterer mitotischer Spezifitätsfaktor des APC. Es konnte nun gezeigt werden, dass erhöhte Mengen an Cdc5 die APCCdc20-abhängige Pds1-Degradation in Metaphase-arretierten Zellen induzieren. Eine kinase-inaktive Mutante von Cdc5 zeigt diesen Effekt nicht mehr. Gleichzeitig scheint Pds1 aber auch ein Aktivator von Cdc5 zu sein, da die Deletion von PDS1 die Wirkung der Überexpression von CDC5 auf Clb2 und Sic1 negativ beeinflusst. Cdc5 interagiert außerdem mit Lte1. Lte1 ist der GEF (guanine nucleotide exchange factor) des G-Proteins Tem1 und aktiviert dieses durch den Austausch von gebundenem GDP zu GTP. Auf diese Weise stimuliert Lte1 den Austritt aus der Mitose. Lte1 zeigt eine zellzyklusabhängige Phosporylierung und obgleich vornehmlich phosphorylierte Formen von Lte1 mit Cdc5 interagieren, ist Cdc5 nicht direkt für die Phosphorylierung von Lte1 verantwortlich. Ein weiterer bisher unbekannter Interaktionspartner von Cdc5 ist Rad9. Rad9 ist Teil eines Kontrollsystems, das bei einer Beschädigung der genomischen DNA zu einem Zellzyklusarrest vor dem Beginn der Anaphase führt. Dadurch bleibt der Zelle Zeit, den Schaden zu reparieren bevor sie sich erneut teilt. Ein derartiger Kontrollmechanismus gewährleistet die Integrität des genetischen Materials, das an die Nachkommen weitergegeben wird. Erhöhte Mengen an Cdc5 beeinflussen die Modifikation von Rad9. Außerdem bewirken sie, dass Zellen, die aufgrund eines DNA-Schadens in der Metaphase arretiert sind, teilweise ihre Kerne teilen und die Spindel auflösen. Dies ist begleitet von einer Degradation von Pds1.