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Open Access
Aspects of mitogen-activated protein kinase cascade activation by epidermal growth factor (EGF): kinetics and crosstalk mechanism with tumor necrosis factor alpha (TNFalpha)
(2002) Beck Eichler-Jonsson, Claudia; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Using a mathematical/computational model developed on known components of epidermal growth factor (EGF) signaling pathway (Schoeberl, 2002), several aspects of the EGF signaling pathway could be evaluated and validated when compared to experimental data. The model provided insight into signaling response relationships between the ligand binding to the EGF receptor at the cell surface and the activation of downstream responses, for example, the phosphorylation of ERK-1/2 and expression of the target gene, c-fos. Concentration dependent-inhibition of MEK1 kinase reflected on inhibition of EGF-induced ERK-1/2 phosphorylation and the experimental data correlated well with mathematical model simulation. TNF was able to induce ERK-1/2 phosphorylation in a manner dependent on MEK-1 activation but, unlike EGF-mediated MAPK activation, it seemed independent of Ras, Raf or MEKK1. Despite ERK activation, induction of Elk-1 transcriptional activity and c-fos expression were not observed following TNF stimulation in contrast to EGF-treated cells. These data indicate, first, the existence of an alternative route to ERK phosphorylation by TNF other than the classical Ras-Raf pathway and, second, the existence of transcriptional response specificity which may depend on the amplitude and duration of ERK activation induced by diverse stimuli. Besides activating fairly known specific signaling transduction pathways which lead among others to NF-kB and JNK activation, TNF has been shown to be involved in crosstalk with other receptors, a phenomenon much less understood. In the work presented here the features of crosstalk mechanisms between EGF and TNF signaling pathways were investigated. Short time TNF pre-incubation (3 min) prior to EGF stimulation resulted in additive ERK-1/2 phosphorylation whereas 30 minutes pre-incubation induced decrease on EGF-mediated ERK-1/2 phosphorylation as well as on Raf-1 kinase activation of HeLa cells. However, no apparent differences were observed in the levels of EGF-induced EGFR phosphorylation. Moreover, confocal microscopy showed no physical interaction between the two receptors. Although ceramide formation has been regarded as an important mediator of some TNF-dependent responses, it seems not to play any role in the inhibitory effect in the EGF response of HeLa cells observed after 30 min TNF pre-treatment as no increase in cellular ceramide was detected during this time. In addition, inhibitors of the de novo pathway of ceramide formation did not revert TNF-mediated inhibition of EGF-induced Raf kinase activation and ERK-1/2 phosphorylation in HeLa cells. Taken together, these results suggest that TNF negatively regulates EGF-induced ERK-1/2 activation at the level of c-Raf kinase, in a manner independent of ceramide formation.
Open Access
Charakterisierung rekombinanter Kathepsin B-Fluoreszenzproteinchimären in Lungentumorzellen : Möglichkeiten neuer fluoreszenzspektroskopischer Verfahren
(2005) Bestvater, Felix; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Genetische Konversion bei simultaner Kotransfektion GFP-Varianten mit hoher Sequenzidentität werden häufig für Mehrfachmarkierungen eingesetzt. Ihre simultane Kotransfektion kann zu einer Konversion der Fluoreszenzeigenschaften führen und so die Interpretation von Experimenten beeinträchtigen. Unter Standard-Transfektionsbedingungen ergaben ~8%, bei deren Variation bis zu 26% der permanent exprimierenden Zellen veränderte Fusionsproteine. Es wurde gezeigt, daß der Effekt auf der Rekombination homologer Nukleotidsequenzen basiert. Sukzessive Transfektion oder niedrige Sequenzidentität verhinderten die Rekombination. Die genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Konversionsraten gestattet allgemeine Untersuchungen von Rekombinations- und Reparatur-Prozessen. Zwei-Photonen-Anregung Fluoreszenzspektren für zahlreiche zellbiologisch relevante abiotische Fluorochrome sowie Zellextrakte verschiedener GFP-Varianten wurden mittels der Zwei-Photonen-Anregung generiert. In den meisten Fällen gab es keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Zwei-Photonen- und den Ein-Photonen-Emissionsspektren. Die Absorptionsmaxima der breiteren und differenzierteren Zwei-Photonen-Kurven waren jedoch meist um wenige Nanometer bis hin zu weitläufig abweichenden Spektralverläufen blau-verschoben. Die Fluoreszenzintensität der GFP-Varianten war bei beiden Anregungsarten pH-abhängig und hatte ihre maximale Emission im Alkalischen. Trotz einer unvollständigen Regenerierung der Fluoreszenz nach Ansäuerung blieb das Spektralprofil unverändert. Zwei-Photonen-Mikroskopie in Verbindung mit 3D-Rekonstruktion wurde erfolgreich eingesetzt, um subzelluläre Strukturen in vivo hochaufgelöst darzustellen. In vivo-Charakterisierung von Kathepsin B (CB) Entstehung und Verteilung von CB wurden unter Verwendung rekombinanter CB-Konstrukte und Fluoreszenzproteine (FP) untersucht. Das CB-FP-Fusionsprotein wurde nur in konstitutiv exprimierenden Zellen prozessiert. Es lokalisierte in retikulären und vesikulären Kompartimenten sowie in Assoziation mit der Plasmamembran. Versuche mit Transportinhibitoren sprechen für eine reguläre Sortierung via M6P-Weg. Fluorometrische Aktivitätsmessungen an Zellextrakten, Zellkulturüberständen und isolierten Zellkernen ergaben eine stark erhöhte CB-Aktivität in Zellklonen. Ein neuartiger Ansatz zur Inhibition der CB-Enzymaktivität wurde mit Hilfe rekombinanter Stefin B (StB)-Inhibitoren unternommen. Die Adressierung von StB ins ER/Golgi durch eine vorgeschaltete Zielsequenz ergab keine stärkere Inhibierung von CB gegenüber den zytoplasmatischen StB-Varianten. Die Überexpression des CB führte zu einer geringen Erhöhung der Enzymaktivitäten von endogenem Kathepsin K und L. Dies kann auf eine mögliche Koregulation mit CB bzw. eine generelle Hochregulierung degradierender Peptidasen aufgrund eines erhöhten Proteinpegels zurückgeführt werden. Die Verwendung FP-markierter rekombinanter CB-Konstrukte eignet sich daher gut als in vivo-Modell zur Charakterisierung von nativem CB. Nukleäres CB und Zelltod Alternative CB-Spleißvarianten führen zu einem Translationsprodukt, dem Signalpeptid und Teile des Pro-Peptids fehlen. Dieses nativ trunkierte d51CB kann daher nicht regulär prozessiert und sortiert werden. Statt dessen wird es über eine aktivierte N-terminale Zielsequenz in die Mitochondrien geleitet. Obwohl d51CB vermutlich keine typische CB-Enzymaktivität besitzt, könnte es unabhängig von der Funktion des regulären Enzyms eine Rolle bei Malignität spielen und Zelltod verursachen. Neben d51CB kann auch reifes CB als Folge beschädigter Lysosomen zytoplasmatisch auftreten. Solche "aberranten" CB-Formen wurden mit Hilfe künstlicher CB-FP-Mutanten untersucht. d51CB wurde überwiegend in Mitochondrien und z.T. im Zellkern nachgewiesen. Die künstlich trunkierte CB-Einzelkettenform wurde nicht prozessiert und zeigte keine reguläre CB-Enzymaktivität während transienter Expression in Lungentumorzellen. Sie kam im Zytoplasma, im Zellkern und in der Midbody-Matrix mitotischer Zellen vor. Bleichstudien wiesen mobile und immobile nukleäre Fraktionen nach. Die Anreicherung von künstlich trunkiertem CB im Zellkern führte zu dessen Auflösung und zu Zelltod. Vermutlich werden diese Phänomene nicht über die reguläre CB-Enzymaktivität, sondern über ein noch unbekanntes Aktivitätsprofil ausgelöst. Die Molekülregion, die den Kernimport vermittelt, ist gemäß einer Mutationsanalyse ein zusammengesetztes Signal innerhalb der schweren Kette des CB. Die Ergebnisse legen nahe, daß CB neben dem Signalpeptid und der mitochondrialen Zielsequenz weitere Signale enthält, die für seine differenzierte Adressierung in den Zellkern, in Vesikel oder in andere Organellen verantwortlich sind. Hier wird eine Hierarchie von Zielsignalen im CB-Molekül postuliert, die durch ihre Verfügbarkeit und Stärke bestimmt wird. Diese schließt alternative Transportmechanismen neben dem üblichen M6P-Weg ein.
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A combinatorial engineering approach to increase the productivity of CHO cells, and proteomic analysis of cell culture supernatant
(2008) Becker, Eric; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
The optimization of production processes for therapeutic antibodies is a continuing challenge in pharmaceutical biotechnology. It has been demonstrated that vector design and host cell engineering can improve transcriptional and translational efficiency, resulting in the generation of high producer cell lines. However, the introduction of transgenes into production cell lines that regulate protein transport or affect post-translational modifications have been reported in the literature to lead to inconsistent results regarding the improvement of industrial processes. The present study shows that heterologous expression of the spliced form of transcription factor X-box-binding protein 1 (XBP-1(s)) leads to an increase in ER content in adherently growing Chinese hamster ovary (CHO) cells. Furthermore, specific therapeutic antibody productivity was elevated by 60% in CHO cells grown in inoculum suspension cultures. This dose-dependent effect translated into significantly increased overall antibody titers in a fed-batch format where cells were grown in chemically defined serum-free media. Protein-A purified antibody products from mock cells and XBP-1 transfected cells were found to be of comparable quality with regard to glycosylation pattern and physicochemical characteristics. The data demonstrated the potential of XBP-1 engineering to improve mammalian cell culture production processes to yield high amounts of a therapeutic protein product of desired quality. However, only low numbers of cells expressing the transgene at high levels were found during the generation of stable cell lines. Additionally, XBP-1(s) expression in monoclonal cell lines was found to decrease over a prolonged period of seed-stock cultivation. These observations were verified by colony formation assays (CFA) where XBP 1(s) expression led to significantly lower colony counts. In an additional experimental setting it was demonstrated that XBP-1(s) expression enhanced apoptosis in CHO cells. Altogether, the data demonstrated a survival disadvantage upon XBP-1(s) overexpression in engineered CHO cells, hampering a possible commercial cell line development program based on XBP-1 engineered cells. To overcome the XBP-1(s) mediated apoptosis, co-expression of the anti-apoptotic protein x-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) and XBP-1(s), combining secretion engineering and anti-apoptosis engineering, was evaluated. The proof-of-concept was demonstrated by colony formation assays (CFA), where concomitant XIAP and XBP-1(s) expression was able to restore colony counts. Moreover, when an mAb-producing CHO cell line was engineered, the bicistronic overexpression of both transgenes showed highest specific productivities and final titers in fed-batch cultures of polyclonal cell lines when compared with control cells. The data demonstrated a path toward optimized mammalian production processes. However, despite the proof-of-concept for the two transgenes approach on a pool level it proved challenging to transfer this idea from a model system to the final stages of industrial cell line development. An additional building block for reproducible high-yielding production processes is sophisticated process monitoring. To be able to identify marker proteins which as a result of their concentration can indicate, for example, transitions between process phases during a production run, an analytical method was developed to investigate changes in the proteome of cell culture supernatant samples. In this approach, the proteome of the supernatant was analyzed by differential two-dimensional gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to eliminate interfering effects of the protein product of producer cell lines on the separation method, a mock cell line was generated. This mock cell line was selected to closely simulate production processes with comparable cellular growth characteristics but without product formation. For the concentration of supernatant samples precipitation and ultrafiltration were compared and the filtration method was finally selected. A first analysis of supernatant samples derived from three different process times of a batch culture demonstrated the applicability of the method to separate and finally identify proteins with different abundance in process supernatant samples - a prerequisite for possible process marker proteins. Furthermore, the results of this first study were verified by Western blot analysis for one protein. The established method based on separation of the proteins from the supernatant by 2D-DIGE and subsequent identification by peptide mass fingerprinting using mass spectrometry can now be used as a starting point for further characterization studies. The identification of such process marker proteins is the first step toward next-generation bioprocess monitoring and control and provides an opportunity for further improved high-yielding production processes.
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Duale Regulation von Cofilin durch Proteinkinase D (PKD) vermittelte Phosphorylierung der Phosphatase SSH1L und der LIM-Kinase 2
(2011) Peterburs, Philipp; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Das Verständnis von Metastasierung bei Krebserkrankungen ist eine der größten Herausforderungen für die Entwicklung neuer Medikamente. Dies erfordert die Erforschung der Signalwege, die die Organisation des Aktinzytoskeletts sowie Tumorzellmigration und -invasion steuern. In dieser Arbeit konnte die Rolle von Proteinkinase D (PKD) in der Reorganisation des Aktinzytoskeletts und der Zellmigration entschlüsselt werden. Aus vorangegangenen Studien war bekannt, dass PKD die Zellmigration negativ reguliert - höchstwahrscheinlich durch die Kontrolle der Aktinpolymerisations-Maschinerie. Die Substrate von PKD in diesem Prozess waren bisher jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte die Cofilinphosphatase Slingshot 1 Like (SSH1L) als Substrat von PKD identifiziert werden. Cofilin induziert die Aktinpolymerisation durch das Schneiden von F-Aktin Filamenten. Auf diesem Wege werden neue, freie sogenannte stumpfe Enden (“barbed ends”) generiert. Weiterhin steigert Cofilin die Aktindepolymerisation, wodurch der Pool an Aktin-Monomeren erhöht wird. Aus diesen Gründen kann Cofilin als Schlüssel-Regulator in der Zellmigration bezeichnet werden. Die Aktivität von Cofilin ist von seiner Phosphorylierung abhängig: Eine Phosphorylierung durch die LIM-Kinasen 1 und 2 hemmt die Fähigkeit von Cofilin an Aktin zu binden und führt damit zu dessen Inaktivierung. Entsprechend führt eine Dephosphorylierung des Proteins durch SSH- und Chronophinphosphatasen zur Aktivierung. PKD phosphoryliert die Serine 937 und 978 in SSH1L in vitro und in intakten Zellen und induziert dadurch die Bindung von 14-3-3 Proteinen, die die zelluläre Lokalisation von SSH1L regulieren. Auf diesem Weg wird die lokale Aktivität von Cofilin kontrolliert. Ein Verlust der PKD-Expression führt daher zu einer verringerten Phosphorylierung von Cofilin, einer ausgebreiteten Zellmorphologie und einer gesteigerten gerichteten Zellmigration in Abhängigkeit von SSH1L. Darüber hinaus konnte für PKD eine Funktion bei der Regulation von LIMK2 gezeigt werden. PKD phosphoryliert LIMK2 in vitro und in intakten Zellen an Serin 289, was ebenfalls eine Bindung an 14-3-3 Proteinen zur Folge hat. Die Überexpression einer phosphorylierungsdefizienten LIMK2 S289A Variante führt im Vergleich zum wildtypischen Protein zu einem schwächeren Anstieg von phosphoryliertem Cofilin. In Migrationsstudien führte eine Überexpression von LIMK2 zu einer reduzierten Zellmigration während die Überexpression von LIMK2 S289A zu einer gesteigerten Zellmigration im Vergleich zu den Kontrollzellen führte. Diese Ergebnisse lassen auf eine aktivierende Wirkung der Phosphorylierung von LIMK2 an Serin 289 schließen. In dieser Arbeit wurde damit eine duale Funktion von PKD in der Cofilin-abhängigen Zellmigration aufgedeckt: PKD kontrolliert Cofilin-Aktivität über eine negative beziehungsweise positive Regulation von SSH1L und LIMK2.
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Entwicklung eines autologen Fettgewebeersatzes mit angiogenen Eigenschaften auf Basis einer adipogenen Alginatmatrix in Kombination mit humanen mesenchymalen Stammzellen
(2013) Handel, Marina; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Die Rekonstruktion von subkutanem Fettgewebe stellt die Plastische Chirurgie noch immer vor eine große Herausforderung, denn für großflächige Gewebeschäden steht meist nicht ausreichend patienteneigenes Gewebe zur Verfügung. In der Regenerativen Medizin arbeitet man daher an künstlichem Fettgewebeersatz. Aufgrund der schlechten Vaskularisierung weisen diese Ansätze jedoch eine unzureichende Nährstoffversorgung auf, woraus eine Transplantatvolumenreduktion von bis zu 60 % resultiert. In dieser Arbeit wurde daher der Ansatz des "Adipose Tissue Engineering" (ATE) verfolgt, einer neuen Variante zur Rekonstruktion von subkutanem Fettgewebe. Geeignete Trägerstrukturen (z.B. textile Implantate) wurden mit patienteneigenen Vorläuferzellen besiedelt und zu Fettzellen differenziert, um autologes Fettgewebe in situ - de novo zu generieren. Dieser Fettgewebeersatz auf Basis humaner Stammzellen aus Fettgewebe (hASC) zeigte dabei ausgeprägte angiogene Eigenschaften. Das adipogene Differenzierungspotenzial sowie die Sekretion pro-angiogener Zytokine der hASC wurde ermittelt. Ein spezifischer VEGF-Knockdown bestätigte VEGF als potentes pro-angiogenes Zytokin, weshalb die VEGF-Sekretion stellvertretend für weitere pro-angiogene Zytokine humaner ASC ermittelt wurde. Standardisierte in vitro Angiogenese-Modelle belegten ein erhöhtes angiogenes Potenzial hASC besiedelter Implantate. Diese in vitro Ergebnisse wurden mit dem in vivo CAM Angiogenese Assay bestätigt. Die Kombination von Implantatmaterialien mit hASC zeigte auch hierbei stets ein verbessertes angiogenes Potenzial. Mit fortschreitender adipogener Differenzierung nahm die VEGF-Sekretion humaner ASC hingegen rapide ab. Um das pro-angiogene Potenzial der Vorläuferzellen post transplantationem nutzen zu können, ist daher zu empfehlen, native hASC zu verwenden. Hierzu wurden erste adipogene Alginatstrukturen entwickelt, welche über integrierte Differenzierungsfaktoren eine adipogene Differenzierung immobilisierter hASC induzierten. Die Ergebnisse dieses Ansatz des ATE zeigten auf, dass eine Differenzierung der Vorläuferzellen durch das Scaffoldmaterial post transplantationem induziert werden kann, was aus therapeutischer Sicht sowohl die erforderliche VEGF-Sekretion humaner ASC und somit das angiogene Potenzial zum Zeitpunkt der Implantation sicherstellen, als auch die Zeitspanne vor einer Geweberekonstruktion deutlich verkürzen würde.
Open Access
Entwicklung von molekularen Werkzeugen zur Untersuchung einer Funktion der Proteinkinase D in der Organisation des Golgi Komplexes
(2012) Eisler, Stephan Alexander; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Die Proteinkinase D (PKD) Familie der Serin/Threonin Kinasen umfasst in Säugerzellen drei Mitglieder: PKD1, PKD2 und PKD3. PKDs werden downstream von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) als Effektoren von Diacylglycerol (DAG) aktiviert. Sie sind an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, wie z.B. Zellmotilität, Überleben der Zelle bei oxidativem Stress und Aktivität von Transkriptionsfaktoren beteiligt. Am besten beschrieben ist die Funktion am Golgi Komplex. Hier kontrolliert PKD am Trans-Golgi Netzwerk (TGN) die Abschnürung von Transportvesikeln. Der Aktivierungsstatus von PKD ist stets streng reguliert und die jeweilige Funktion eng mit der subzellulären Lokalisierung verknüpft. Genetisch codierte, Fluoreszenz-basierte Kinaseaktivitätsreporter sind wichtige molekulare Werkzeuge, um die räumliche und zeitliche Veränderung von Kinaseaktivität auf subzellulärer Ebene zu beobachten und somit die Antwort der Kinase auf Veränderungen der physiologischen Umgebung zu erfassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei dieser Reporter, die spezifisch für die Messung von PKD-Aktivität am Golgi Komplex eingesetzt werden können, entwickelt. Bei beiden Reportern wird die PKD-Aktivität über den Phosphorylierungsstatus der PKD-Substratsequenz von Phosphatidylinositol-4 Kinase IIIβ (PI4KIIIβ) visualisiert. Der erste Reporter, G-PKDrep wurde für Aktivitätsmessungen in fixierten Zellen entwickelt, wobei der Phosphorylierungsgrad der Substratsequenz mit einem phosphospezifischen Antikörper quantifiziert wird. Mit G-PKDrep-live wurde G-PKDrep zu einem FRET-basierten Reporter weiterentwickelt, mit dem PKD-Aktivität am Golgi Komplex in lebenden Zellen über die Zeit gemessen werden kann. Mit Hilfe von G-PKDrep konnte unter Verwendung der Mikrotubuli-zerstörenden Substanz Nocodazol eine Funktion von PKD in der Organisation des Golgi Komplex aufgezeigt werden. Hierbei wurde gezeigt, dass die durch Mikrotubuli-Verlust hervorgerufene Golgi-Fragmentierung abhängig von PKD-Aktivität ist. Zur Aufklärung der zugrunde liegenden Signalwege dieses Prozesses wurde eine globale SILAC-basierte Phosphoproteom-Studie durchgeführt. Durch Expression einer kinasetoten PKD wurden dabei 124 PKD-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert, die unter Nocodazolbedingungen signifikant herabreguliert waren. Dabei wurden viele PKD-Zielsequenzen in Golgi-residenten Proteinen, z.B. Mitglieder des IGF2-Rezeptor Netzwerks, identifiziert. Zudem zeigte sich, dass PKD nach Nocodazolstimulation den MAP-Kinase Signalweg aktiviert, dessen downstream Effektoren zu Beginn der Mitose die Golgi-Fragmentierung initiieren. Im Zellzyklus fragmentiert der Golgi Apparat beginnend in der G2-Phase in einem sequenziellen Prozess, wobei die anfängliche Spaltung des Golgi-Bandes in einzelne Golgi-Stapel essenziell für den Eintritt der Zelle in die Mitose ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Trennung der Golgi-Stapel PKD-abhängig ist und dass PKD somit eine Funktion beim Eintritt der Zelle in die Mitose hat. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass PKD bei diesem Prozess upstream vom MAP-Kinase Signalweg agiert. Zusammengefasst konnte mit Hilfe der in dieser Arbeit entwickelten und etablierten molekularen Werkzeuge eine bisher unbekannte Funktion von PKD in der Organisation des Golgi Komplex beschrieben werden.
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Generation of colo rectal cancer targeting TRAIL fusion proteins and a mesenchymal stem cell line for in situ expression of these proteins
(2016) Marini, Irene; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
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Identification of novel protein binding partners for the tumor suppressor DLC1
(2009) Heering, Johanna; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Cancer, one of the major chronic health problems worldwide, is a genetic disease, which requires the cooperation of gain-of-function and/or loss-of-function mutations to either oncogenes or tumor suppressor genes, respectively. In the last decade, the Deleted in Liver Cancer (DLC) 1 gene has emerged as a novel tumor suppressor downregulated in a variety of cancer types including breast, liver, prostate and lung. DLC1 is a multidomain protein consisting of an N-terminal sterile alpha motif (SAM), a C-terminal START and an internal Rho GTPase activating (GAP) domain. Due to GAP-dependent and -independent mechanisms that are still poorly understood DLC1 is able to inhibit proliferation, migration and invasion of tumor cells. The goal of this thesis was the identification of novel DLC1 protein binding partners, in order to gain deeper insight into DLC1 regulation and molecular function. Therefore, a yeast-two-hybrid screen based on the Gal4-system was performed, using the DLC1 SAM domain as a bait and a cDNA library derived from human breast tissue as a prey. One of the 16 putative binding candidates identified was the phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN), which is also a tumor suppressor frequently deleted or mutated in sporadic tumors of the breast, prostate, endometrium and brain. PTEN consists of an enlarged catalytic site that acts as a dual-specificity phosphatase for proteins and lipids. By dephosphorylation of its major lipid substrate phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3) the PI3K signaling pathway is downregulated and cell proliferation and survival mediated by Akt/PKB activation are inhibited. Cell spreading and cell motility are also suppressed by PTEN activity. Pulldown assays and coimmunoprecipitation of DLC1 and PTEN confirmed association of the proteins in mammalian cells. The interaction of both proteins was stimulated upon PTEN activation by PDGF treatment, correlating with their colocalization at the plasma membrane. In overexpression experiments synergistic effects of the two proteins with regard to downstream signaling could not be observed. However, simultaneous loss of DLC1 and PTEN in the non-invasive MCF7 breast carcinoma cell line using RNA interference enhanced migration in an additive manner in wounding as well as in chemotactic transwell assays compared to singly depleted cells. These results suggest that the spatio-temporally restricted formation of a DLC1/PTEN complex, simultaneously inhibiting its individual downstream targets, guarantees the synchronization of cell migration processes. Thus, loss of both proteins is proposed to facilitate malignant transformation by increasing the metastatic potential of tumor cells. Another putative DLC1 binding partner identified in the yeast-two-hybrid screen was liprin beta2 that belongs to a protein familiy comprising four alpha- and two beta-type family members, which all contain a C-terminal highly conserved liprin homology (LH) domain consisting of three SAM domains. Association of full-length DLC1 with liprin beta2 as well as with the additional family members liprin alpha1 and beta1 was confirmed biochemically by coimmunoprecipitation. Liprins are multivalent proteins that form complex structures due to homo- and heterodimerization. Additionally, alpha-type liprins interact with the LAR subfamily of receptor protein-tyrosine phosphatases, which are heterophilic receptors involved in cell adhesion and cell motility. Given the function of liprins as adaptor proteins at membrane proximal sites, it is conceivable that they contribute to DLC1 localization and/or scaffolding. It is thus of particular interest to investigate the biological impact of DLC1 binding to liprin proteins in future studies.
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Identifizierung und Charakterisierung von Endosialin, einem C-Typ Lektin-ahnlichen Rezeptor auf Tumorendothel
(2001) Christian, Sven; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Endosialin wurde als ein 165 kDa Zelloberflächenantigen durch den monoklonalen Antikörper FB5 identifiziert (Rettig et al., 1992). Immunhistochemische Versuche mit diesem Antikörper auf humanen Geweben zeigten eine selektive Expression des Antigens auf Blutgefäßen von 67 aller getesteten Tumorgewebe. Für die biochemische und funktionelle Charakterisierung dieses Antigens sollte die Endosialin-exprimierende Neuroblastomzellinie LA1-5s als Quelle für eine Proteinaufreinigung dienen. Das gereinigte Protein wurde tryptisch verdaut und die Aminosäuresequenz von sechs isolierten Peptiden in der anschließenden Edman-Sequenzierung bestimmt. Ein Prosite-Pattern-Search mit den erhaltenen Sequenzen führte zur Identifizierung eines 330 bp langen EST-Klons (AI371224), dessen korrespondierende Aminosäuresequenz mit fünf der sechs Peptide übereinstimmt. Die Sequenzierung des kompletten EST-Klons und Datenbanksuchen nach weiteren EST-Klonen führten zur Identifizierung eines offenen Leserasters mit einem Stop-Codon und einem putativen Polyadenylierungssignal am 3' Ende. Das putative Start–ATG wurde mit Hilfe der 5'-RACE-Technologie isoliert. Die Endosialin cDNS besteht aus einem offenen Leseraster von 2274 bp und kodiert für ein Typ I Transmembranprotein mit 757 Aminosäuren. Bioinformatische Analysen ergeben, daß das Protein aus einem globulären Teil (C-Typ-Lektin Domäne, Sushi Domäne, drei EGF-Repeats) und einem nicht globulären Teil (Mucin-ähnliche Domäne, Transmembranregion und ein kurzer intrazellulärer Bereich) besteht. Im globulären Teil weist das Protein eine 39 ige Homologie zu Thrombomodulin und eine 33 ige Homologie zu C1qR auf. Rekombinantes in HeLa-S3 Zellen exprimiertes Endosialin wird ebenso wie endogen–exprimiertes Protein vom monoklonalen Antikörper FB5 erkannt und zeigt eine deutliche Membranlokalisation, sowie eine Färbung eines perinukleären Kompartiments. Das Proteins ist durch einen hohen Anteil O-gebundener Zucker, insbesondere Sialinsäure, modifiziert.
Open Access
Immunotherapy of cancer: protective immunization against tumor cell growth with a mutated p53 allele
(1999) Humar, Matjaz; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Bestimmte Onkogen- und Tumorsuppressorgen-Produkte werden als tumorspezifische Antigene präsentiert, wenn sie in malignen Krebszellen überexprimiert und prozessiert werden. Als Grundlage für die Entwicklung neuer experimenteller Krebstherapien kann die Spezifität und die systemische Überwachung durch das Immunsystem genutzt werden. Dadurch können Tumorzellen mit definierten Onkogen-Mutationen in ihrem Wachstum inhibiert und eliminiert werden. Wir hatten die Absicht eine solche Immunantwort als Mittel der Krebstherapie zu induzieren.
Open Access
Inhibition des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs zur Überwindung der Therapieresistenz beim malignen Melanom
(2013) Niessner, Heike; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Das Melanom gehört zu den malignen Tumoren des Menschen, die im Verlauf der Erkrankung mit hoher Wahrscheinlichkeit Gehirnmetastasen ausbilden, die zum Tod des Patienten führen. In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil dargelegt, dass die Inhibition des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs die Sensitivität von Melanomzellen gegenüber Chemotherapie erhöht. Der PI3K Inhibitor LY294002 und der mTOR Inhibitor Rapamycin kombiniert mit Cisplatin oder Temozolomid supprimierten das antiapoptotische Bcl-2 Familienprotein Mcl-1 und induzierten effizient Apoptose in Melanomzellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass der FTI Lonafarnib in Melanomzellen den mTOR-Signalweg inhibiert und die proapoptotischen Effekte von Sorafenib in Melanomzellen verstärkt. Die Apoptoseinduktion durch Lonafarnib und Sorafenib ging mit einer Herunterregulation des Bcl-2 Familienproteins Mcl-1 einher. Darüber hinaus regulierten Lonafarnib und Sorafenib die ER-Stress Gene p8 und CHOP hoch und induzierten ER-Stress vermittelte Apoptose. Im dritten Teil der Arbeit wurde dargelegt, dass die Hyperaktivierung des AKT-Überlebenssignalwegs in Melanomhirnmetastasen durch Mikromilieu-spezifische Faktoren, die von Astrozyten sezerniert werden, hervorgerufen wird. Die Inhibition des aktivierten PI3K-AKT-Signalwegs hemmte hocheffizient das Wachstum von Hirnmetastasen im Mausmodell. Die in den drei Teilprojekten erarbeiteten Daten sprechen dafür, dass der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Therapieresistenz des Melanoms spielt und dass die effiziente Inhibition dieses Signalwegs eine vielversprechende Strategie zur Überwindung der Therapieresistenz des Melanoms darstellt.
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Molekulare Mechanismen der Antiöstrogenwirkung beim Mammakarzinom
(2002) Buck, Miriam; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Antiöstrogene haben sich als sehr effektiv in der Behandlung hormon-responsiver Mammakarzinome erwiesen. Im Verlauf der Therapie kommt es jedoch in der Regel zu einem Verlust der anithormonellen Wirkung. Die an der Entstehung der Antihormonresistenz beteiligten Mechanismen sind weitgehend ungeklärt. Ein entscheidender Schritt zur Aufklärung der antihormonellen Wirkung war die Beobachtung, dass die Behandlung hormonsensitiver Mammakarzinomzellen zu einer Aktivierung des inhibitorischen Wachstumsfaktors TGFb führt. Am Modell-System hormon-sensitiver MCF-7 Mammakarzinomzellen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Beteiligung des TGFb-Systems an der Wirkung des nicht-steroidalen, partiellen Antiöstrogens 4-Hydroxytamoxifen und des steroidalen, reinen Antiöstrogens ICI 182.780 untersucht. Die Ergebnisse sollen zum besseren Verständnis der Interaktionen zwischen Hormonen und Wachstumsfaktoren und den damit im Zusammenhang stehenden Mechanismen der Antiöstrogenresistenz beitragen. Im Mittelpunkt des ersten Teils der Arbeit stand die antiöstrogene Regulation des TGFb-Systems. Untersucht wurde die Expression der Liganden TGFb1 und TGFb2, der Rezeptoren TbRI und TbRII und von Smad7. Zur genauen Quantifizierung der mRNA-Expression dieser Gene wurden spezifische LightCycler RT-PCRs etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur TGFb2 sondern auch TbRII einer antihormonellen Regulation unterliegt. Die Stärke der Induktion beider Gene korrelierte mit der wachstumsinhibitorischen Wirkung der Antiöstrogene. Smad7 wurde nur schwach durch Antiöstrogen induziert, TGFb1 und TbRI gar nicht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht Aufschluss darüber zu erhalten, welche Zweige des komplexen TGFb Signaltransduktionssystems an der antiöstrogenen Wirkung beteiligt sind. Als Endpunkt wurde u.a. die Aktivierung TGFb-sensitiver Promotoren untersucht. Das Reporterplasmid p3TP-lux wurde durch Antiöstrogene ca. 2fach stärker aktiviert als durch TGFb. Über Koexpression dominant-negativer TGFb-Rezeptoren und dominant-negativer Smad4-Proteine konnte gezeigt werden, dass die anitöstrogene Aktivierung von p3TP-lux TGFb vermittelt ist und über den Smad-Signaltransduktionsweg verläuft. Obwohl das steroidale Antiöstrogen ICI 182.780 einen deutlich stärkeren Effekt auf das TGFb-System hat als das partielle Antiöstrogen 4-Hydroxytamoxifen, war die Aktivierung von p3TP-lux durch beide Antiöstrogene annähernd gleich stark. Für eine vollständige Aktivierung von p3TP-lux ist eine Kooperation zwischen einem TGFb aktivierten Smad-Komplex und c-Jun/c-fos notwendig. Die Induktion von c-fos wird jedoch durch steroidale Antiöstrogene blockiert und kommt daher als Ursache der geringen Induktion von p3TP-lux durch ICI 182.780 in Frage. Da TGFb seine Wirkung neben dem Smad-Signaltransduktionsweg auch über MAP-Kinase-Wege entfalten kann, wurde mit Hilfe spezifischer pharmakologischer Inhibitoren die Beteiligung des MEK/Erk- und des p38-MAP-Kinase-Weges an der antihormonellen Wachstumsinhibition untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der p38-Weg über die Induktion von TGFb2 und TbRII an der antihormonellen Wachstumsinhibition beteiligt ist. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Antiöstrogene verschiedene Gene des TGFb-Signaltransduktionssystems differenziell regulieren. Die Untersuchungen zur Beteiligung der TGFb-Signaltransduktionswege an der antihormonellen Wirkung weisen darauf hin, dass diese differenzielle Regulation, durch die spezifische Aktivierung einiger TGFb-Signaltransduktionswege (Smad, p38) und gleichzeitige Inhibition anderer (MEK/Erk) erreicht wird. Da die Signaltransduktionswege in unterschiedlichem Ausmaß zur Aktivierung der verschiedenen Promotoren beitragen, kommt es unter Antiöstrogeneinfluss zu einer Modifizierung des TGFb induzierten Genexpressionsmusters und der spezifisch antiöstrogenen Wirkung.
Open Access
Neuartige retrovirale Vektorsysteme für die Gentherapie: Entwicklung in Suspension wachsender Verpackungszellinien
(2000) Gutjahr, Thorsten S.; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Mit den zur Zeit verfügbaren adhärenten Verpackungszellinien ist die Produktion retroviraler Vektoren sehr begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, retrovirale Verpackungszellinien zu entwickeln, die in Suspension wachsen und ein 'scale-up' der Vektorproduktion ermöglichen. Es wurde gezeigt, daß Suspensionszellinien fähig sind Retrovirusvektoren transient zu produzieren, doch aufgrund ihrer schlechten Transfizierbarkeit es schwierig ist, eine genügend hohe und stabile Expression der viralen Strukturproteine, sowie des rekombinanten Virusgenoms zu erzielen. Aus diesem Grund wurden adhärente Verpackungszellinien an Suspensionswachstum adaptiert. Dazu wurde eine sichere und hoch effiziente HEK293-Verpackungszellinie hergestellt. Diese sowie die HT1080 abgeleitete FLYA13 wurden unter Verwendung serumfreier Medien an Suspensionswachstum adaptiert. Die in Suspension wachsenden Zellinien waren weiterhin fähig Virusvektoren zu produzieren, wobei die FLYA13- sehr hohe, die HEK293-Suspensionsverpackungszellinie niedrigere Virustiter erzielten. Es wurde gezeigt, daß diese Unterschiede zum Teil auf den verwendeten Medien beruhten. Durch Verwendung optimierter Medien und Kulturbedingungen sollte daher eine Steigerung der Vektorproduktion möglich sein. Neben der Herstellung von Suspensionsverpackungszellinien wurden Studien zum Verhalten von Verpackungszellinien in Langzeitkultur durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß eine Verpackungszellinie im Laufe der Kultivierung immer mehr Kopien an Provirusintegraten hinzubekommt. Die Vermehrung der rekombinanten Provirusintegrate könnte durch retrovirale Mechanismen innerhalb der Zelle und/oder auf Reinfektionen der Produzentenzellen mit den von ihr selbst gebildeten rekombinanten Virusvektoren beruhen. Das solche Reinfektionen möglich sind, wurde in mehreren Experimenten demonstriert. Weiterhin wurde eine Abnahme der Virusproduktionsleistung einer retroviralen Verpackungszellkultur im Laufe einer Langzeitkultivierung festgestellt.
Open Access
Neue TRAIL-Varianten für die zielgerichtete Tumortherapie
(2008) Schneider, Britta; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Die zielgerichtete Apoptoseinduktion in Tumorzellen durch proapoptotische Liganden der TNF-Familie wie TNF, CD95L und TRAIL stellt einen wichtigen, neuen Ansatz in der Tumortherapie dar. Da TRAIL wirksame Aktivität gegenüber Tumorzellen und nur minimale Effekte gegenüber nicht transformierten, normalen Zellen aufzeigt und die systemische Applikation gut verträglich ist, eignet sich dieser Ligand besonders für die Entwicklung eines neuen Behandlungskonzepts. Allerdings zeigen bestimmte rekombinant hergestellte TRAIL-Varianten neben ihrer antitumoralen Wirkung auch Wirkung auf Normalgewebe, z.B. hepatotoxische Aktivität, was mit dem Potential zur Bildung höhermolekularer TRAIL-Aggregate in Zusammenhang steht. Löslicher TRAIL in seiner trimeren Form weist dagegen tumorselektive Eigenschaften auf, ist aber auch durch eine relativ geringe zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen gekennzeichnet, da er nur über den TRAIL-R1 Apoptose induziert. TRAIL-R2 hingegen wird durch membrangebundenen TRAIL oder durch löslichen TRAIL, der durch Antikörper auf der Zellmembran sekundär quervernetzt wurde, aktiviert. Bedeutend ist, dass TRAIL-R2 bei vielen Tumoren der dominant exprimierte TRAIL Todesrezeptor zu sein scheint. Erste Daten klinischer Studien mit TRAIL sind zwar sehr vielversprechend, weisen aber auch darauf hin, dass eine weitere klinische Entwicklung möglicherweise in der Kombination mit anderen antitumoralen Behandlungskonzepten liegt. Da viele Tumoren TRAIL resistent sind, ist in diesem Zusammenhang eine Sensitivierung – durch beispielsweise Chemotherapeutika - gegenüber der TRAIL-induzierten Apoptose unumgänglich, die wiederum auch nicht-transformierte Zellen gegenüber einer TRAIL-Wirkung sensitivieren kann. Dies zeigt auf, dass eine Optimierung der TRAIL Reagenzien hinsichtlich einer Verbessung der spezifischen, zielgerichteten Aktivität sehr wichtig ist. Um die selektiven, antitumoralen Eigenschaften von TRAIL zu verbessern, wurden in dieser Arbeit - durch die gentechnische Fusion mit Tumor-spezifischen scFvs - TRAIL-Fusionsproteine mit Spezifität für ErbB2 und FAP generiert. Des Weiteren wurde eine innovative Formatvariante des TRAIL, das so genannte (single-chain) scTRAIL hergestellt und charakterisiert. Der Vergleich des einzelkettigen scTRAIL zu konventionellem, homotrimerem TRAIL zeigte keine Unterschiede in der Bioaktivität und in der Stabilität (in vitro und in vivo) auf. Die Charakterisierung der Antigen-spezifischen Fusionsproteine scFverbB2-TRAIL und scFverbB2-F-scTRAIL zeigte, dass diese neuen Fusionsproteine in vitro und in ersten präklinischen Anwendungen die Anforderungen an ein zielgerichtetes Tumortherapeutikum erfüllten. Beide Proteine zeigten spezifische Bindung auf ErbB2-positiven Karzinomzelllinien (Colo205-Zellen) und zeigten in vitro eine erhöhte, Antigen-abhängige Bioaktivität, wobei sich das einzelkettige scFverbB2-scTRAIL-Molekül durch die höchste Aktvität auszeichnete. Es konnte ebenfalls in vitro gezeigt werden, dass über die ErbB2-spezifische Bindung an die Zielzellmembran das TRAIL-Fusionsprotein Membran-TRAIL Bioaktivität nachahmt, was über eine effiziente Aktivierung des TRAIL-R2 nachgewiesen werden konnte. Dieses Konzept der zielgerichteten Apoptoseinduktion konnte durch die in vitro Charakterisierung weiterer TRAIL-Fusionsproteine mit Spezifität für FAP unterlegt werden. Im in vivo Xenotransplantationsmodell (humanes Kolonkarzinom205 in NMRI nu/nu Mäusen) wurden schließlich die verbesserten antitumoralen Eigenschaften der hier in der Arbeit entwickelten ErbB2-spezifischen TRAIL-Varianten unter Beweis gestellt. Auch in diesen in vivo Experimenten zeichnete sich das einzelkettige, ErbB2-spezifische TRAIL-Molekül durch die höchste Aktivität aus. Zusammenfassend belegen diese „proof of concept“-Studien in vitro und in vivo die sehr gute antitumorale TRAIL-Aktivität, wobei die Apoptose-Induktion durch die Tumorantigen-spezifischen TRAIL-Varianten noch verstärkt werden konnte. Dementsprechend repräsentiert dieses Design-Konzept eine sehr vielversprechende Strategie zur Verbesserung der antitumoralen TRAIL-Wirkung bei gleichzeitiger Minimierung von potentiellen Nebenwirkungen gegenüber nicht-transformierten Zellen.
Open Access
Population and single-cell based quantitative analysis of protein kinase D-mediated regulation of the cell cycle
(2014) Räth, Sebastian; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
The cell cycle consists of G1, G2, S, and M phase and is a tightly regulated process with various checkpoints to control order and length of the separate phases. A multitude of signal molecules and pathways are involved in this process. In cancer, cell cycle control is often changed and understanding of these changes may result in new therapeutic targets in the treatment of patients. Additionally, cell cycle control is of special interest in stem cells as important decisions of cell fate – to proliferate or to differentiate - are part of cell cycle control. The success of adult stem cell therapeutic applications is thus dependent on in-depth understanding of this regulation. The Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (Fucci) is a sophisticated technology, which can easily determine G1 and/or S/G2/M phases of the cell cycle. The technology analyzes living cells in a spatio-temporal manner using fusion proteins consisting of two distinct cell cycle proteins fused to two fluorophores - a dual color scheme of orange and green. The aim of this thesis was to characterize the influence of Protein kinase D (PKD) using this technology in cells with adult stem cell characteristics and an established human cancer cell line. At first, a characterization of primary human mesenchymal stromal cells (MSC) derived from umbilical cord (UC) and bone marrow (BM) was performed. Furthermore, murine bone marrow stromal cells (mBMSCs) were isolated and osteogenic differentiation was investigated in tissue culture and in vivo. Three out of seven independent cell isolates showed the ability to differentiate into osteocytes, adipocytes, and chondrocytes in vitro. In vitro multipotency of an established mBMSC line was maintained over 45 passages. The osteogenic differentiation of this cell line was confirmed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis of specific markers such as osteocalcin and shown to be Runx2 dependent. Notably, the cell line, when transplanted subcutaneously into mice, possesses full skeletal stem cell characteristics in vivo in early and late passages, evident from bone tissue formation, induction of vascularization, and host derived hematopoiesis. This cell line provides, thus, a versatile tool to unravel the molecular mechanisms governing osteogenesis in vivo thereby aiding to improve current strategies in bone regenerative therapy. Consequently, multipotent mBMSC lines were established from transgenic Fucci mice. Single cell analysis of cell cycle progression was performed in these Fucci-mBMSCs and Fucci transgenic human HeLa cells. Specifically, the influence of protein kinase D (PKD) and the RAF/MEK/ERK pathway on progression through S/G2/M phase was investigated in detail. Inhibition of PKD but not of MEK resulted in a delay in progression through S/G2/M phase in HeLa cells and mBMSCs. Furthermore, MAPK pathway activation was quantitatively assessed during the synchronous progression of HeLa cells through S/G2/M and successfully used to develop a quantitative mathematical model describing this pathway. Taken together this study demonstrates the benefit of quantitative and single cell analysis in cells with stem cell characteristics and an established cell line to enlighten the role of PKD in cell cycle control and, on top of that, support the notion that PKD is a potential new target for cancer therapy.
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Protein kinase D (PKD) mouse models – towards an understanding of the physiological role of PKD
(2008) Ellwanger, Kornelia; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
The three members of the protein kinase D (PKD) family, PKD1-3, have been identified as serine/threonine kinases with functions in fundamental cellular processes as diverse as adhe-sion and motility, proliferation and differentiation, membrane and protein trafficking, regula-tion of gene expression, apoptosis, and oxidative stress signaling. Numerous in vitro studies addressed cell context dependent activation and functional principles of the PKD isoforms. Thus, the molecular mechanisms of PKD regulation and functions are well understood today. However, research about the role of PKD family members in vivo is still in its infancy. Due to its structural characteristics PKD3 is supposed to play a unique role among the three isoforms. In this study, the expression pattern of PKD3 during mouse development was investigated by immunohistochemistry. The expression is differentially regulated throughout early embryogenesis and organogenesis. Compared to other isoforms PKD3 is expressed more ubiquitously, implicating distinct and non-redundant functions within the PKD family. To further elucidate the potential role of PKD in vivo, transgenic mice overexpressing dominant-negative PKD mutants in an inducible and tissue specific manner were generated. Several transgenic lines for each of the three isoforms were established, genetically characterized and analyzed concerning transgene inducibility, expression level, biodistribution, and subcellular localization. For PKD1 and PKD2 transgenic lines were identified to facilitate a considerable overexpression of dominant-negative PKD compared to endogenous PKD, which is required to create a "functional knockout". To identify potential phenotypes provoked by skeletal muscle-specific transgene expression the response of mice to voluntary wheel running was studied. The running performance of mice expressing dominant-negative PKD1 was significantly decreased compared to control mice. Analysis of skeletal muscle fiber type composition after voluntary wheel running revealed that exercise-induced muscle remodeling was blocked in animals with transgene expression. Therefore, our data clearly indicate for the first time in a physiological in vivo model that PKD plays a fundamental role in the regulation of exercise-induced skeletal muscle remodeling. Another functional consequence of transgene expression was observed in the brain. Overexpression of dominant-negative PKD1 in the hippocampus was found to interfere with neuronal Golgi morphology, a result which confirmed previous in vitro data. Together, these findings implicate a key role of PKD in the regulation of neuronal Golgi organization. We conclude that the newly established transgenic mouse model serves as a valuable tool for the analysis of PKD functions in a physiological context and is useful for further studies in this field.
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Regulation of START domain containing proteins through membrane interaction
(2009) Erlmann, Patrik; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
In mammals, there are 15 proteins that contain a lipid-binding START domain and those that have been characterized are able to transfer lipids between membranes in vitro. A prerequisite for START domains to act as lipid carriers is the interaction of the protein with cellular membranes. The goal of this thesis was to investigate how membrane targeting of these START domaincontaining proteins is regulated and affects protein function. Three START family members were studied in greater detail: StarD10, CERT/StarD11 and DLC1/StarD12. StarD10 is a minimal START domain protein with no additional targeting sequences, which was previously shown to transfer phosphatidylcholine (PC) and to a lesser extent phosphatidylethanolamine (PE) in vitro. By mass spectrometry, we identified a novel phosphorylation site in StarD10 at serine 284. We were able to show that casein kinase II mediated phosphorylation of this site reduced lipid transfer in vitro and membrane binding in vivo. However, the intracellular route of lipid transfer by StarD10 still remains to be determined. By contrast, the ceramide transfer protein CERT is known to shuttle ceramide from the endoplasmatic reticulum (ER) to the Golgi complex. Targeting to these organelles is mediated via the FFAT motif that binds to the ER-resident protein VAP and the PH domain that binds phosphatidylinositol-(4)-phosphate (PI(4)P) enriched in Golgi membranes. Here we identified CERT as a novel substrate for Protein Kinase D (PKD) at the Golgi. PKD-mediated phosphorylation at serine 132 is shown to reduce the PH domain-dependent interaction of CERT with PI(4)P-containing membranes and ceramide transfer. Thus, membrane binding of both StarD10 and CERT is negatively regulated by phosphorylation and this results in decreased lipid transfer efficiency. The tumor suppressor protein DLC1 (Deleted in Liver Cancer 1) is a Rho GTPase activating protein (GAP), which contains a START domain of unknown specificity and function. Through its GAP domain DLC1 inactivates the small GTPase RhoA to control actin cytoskeletal remodeling and biological processes such as cell migration and proliferation. In this thesis, DLC1 was found to interact with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) through a previously unrecognized polybasic region (PBR). Interestingly, PI(4,5)P2-containing membranes enhanced DLC1 RhoGAP activity in vitro. In living cells, a DLC1 mutant lacking an intact PBR inactivated Rho signaling less efficiently and was severely compromised in suppressing cell spreading, directed migration and proliferation. PI(4,5)P2 thus appears to be an important cofactor in DLC1 regulation in vivo. The PBR, however, was not sufficient to recruit DLC1 to membranes and its deletion did not alter DLC1 subcellular localization. Instead, we provide evidence for alternative mechanisms towards the regulation of DLC1 localization. DLC1 interaction with the lipid phosphatase PTEN may contribute to plasma membrane localization, while interaction with 14-3-3 adaptor proteins sequesters the protein in the cytoplasm.
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Renal allograft rejection in chemokine receptor Ccr1-/-, Ccr5-/- and Ccr1-/-/Ccr5-/- mice and impact of Ccr5 deficiency on macrophage polarization
(2009) Dehmel, Stefan; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Previous studies showed that loss of the chemokine receptor Ccr1 or Ccr5 has a beneficial effect on survival of cardiac, carotid, corneal and islet allografts in mice. Additionally, human renal allograft recipients homozygous for a null allele of CCR5 (CCR5delta32) experience significantly prolonged allograft survival. To analyze the mechanisms underlying reduced allograft rejection in Ccr1-/- and Ccr5-/- recipient mice, a renal transplantation model was utilized, that allowed the study of the acute (7d) and the clinically more important phase of chronic (42d) allograft rejection. Ccr1-/-/Ccr5-/- mice were included to analyze whether loss of both receptors is accompanied by additional improvements. Reduced graft fibrosis, leukocyte infiltration and improved histopathology were observed in all knock-out groups, but additional improvements in Ccr1-/-/Ccr5-/- recipients were limited to certain aspects at 42d. Ccr1-/- and Ccr5-/- recipients showed significantly diminished mRNA levels of Th1-associated cytokines and chemokines at 7d. Expression of these genes was restored to wildtype levels in Ccr1-/-/Ccr5-/- recipients at 7d explaining the few additional improvements in Ccr1-/-/Ccr5-/- recipients. Ccr1-/- recipients showed Th17-shifted immune responses, while Ccr5-/- recipients exhibited dramatically increased alternative macrophage activation (AMA) at 42d which might explain the beneficial effects on long-term allograft survival observed in CCR5delta32/delta32 human transplant recipients. AMA was also observed in unchallenged spleens and elicited peritoneal macrophage of Ccr5-/- mice indicating a general role for CCR5 in macrophage polarization. Results of bone marrow-derived macrophages suggest that strain differences influence macrophage polarization and that BALB/c allografts favor the induction of AMA in Ccr5-/- macrophage. In conclusion, Ccr1 or Ccr5 deficiency in recipients has beneficial effects on renal allograft rejection though the underlying mechanisms may be different and might lead to the observed ambiguous effects in Ccr1-/-/Ccr5-/- recipients. Furthermore, no indication for redundant functions of CCR1 and CCR5 was found during renal allograft rejection.
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Role of protein kinase D (PKD) in migration, invasion and cell adhesion of pancreas ductal adenocarcinoma cells
(2006) Eiseler, Tim; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
The pancreas ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most common types of cancer, accounting for a large number of cancer related deaths. Rapid tumour metastasis is a major problem in pancreatic cancer, and little is known on the molecular events governing this process, however, features like changes in cell shape, modulation of cell-to-cell adhesion, enhanced cell motility and matrix degrading potential seem to be important. In the literature the Protein kinase D (PKD) family of serine/threonine kinases, which consists of 3 structurally related isoforms, PKD1/PKCμ, PKD2 and PKD3/PKCnu has been implicated in the regulation of some of these processes, yet the molecular mechanisms involved largely remained unclear. That's why this study, using PDAC cell lines, focused on the function of PKD in the metastatic progression of cancer cells. In this work, PKD was found to be strongly expressed and also active in Panc89 cells. Focusing on this cell line, PKD was shown to colocalise with F-Actin and respective markers, indicating active Actin remodeling. For example, Arp3, a member of the Actin-related Arp2/3 protein complex, which is responsible for de novo Actin nucleation and dendritic branching of Actin filaments, colocalised with PKD. Further, PKD colocalised with a subcellular pool of Vinculin at the edge of membrane protrusions, again indicating active Actin turnover, possibly at nascent focal complexes, however PKD was not localised to Vinculin-positive mature focal adhesions to the substratum. In addition, PKD localised with Cortactin, which is enriched within lamellipodia and membrane ruffles. It is implicated in the stabilisation of F-Actin branch points and therefore exhibits important functions at the cortical F-Actin cytoskeleton, which are directly linked to cell migration. Surprisingly, PKD was also found to directly bind to F-Actin in vitro. The binding domain was mapped to 46 amino acids in the N-terminal region of PKD. An alignment of the respective PKD sequence indicated highly conserved motifs, both amongst PKD isoforms and also between human, mouse, and Drosophila species, pointing to a general feature of PKDs. Apart from the binding to F-Actin, PKD and Cortactin also interacted biochemically and PKD was shown to phosphorylate Cortactin in vitro at S298, as well as at additional unspecified sites. Unfortunately an in vivo phosphorylation of Cortactin could not be demonstrated up to now. Employing stable Panc89 cell lines, PKD1 impaired 3D cell migration, while for PKD1KD expressing cells, migration was enhanced. These effects can either be explained by a model implicating Cortactin phosphorylation by PKD in the regulation of F-Actin turnover and rigidity, or by the phosphorylation of yet unknown PKD substrates at the respective F-Actin-rich structures, negatively regulating cell migration. Since mutation of the potential Cortactin phosphorylation site Ser298 to an alanine residue also increased cell migration in stable Panc89 cells, Cortactin might be a potential target of PKD in the regulation of F-Actin dynamics. PKD has also been implicated in the regulation of Ca2+-dependent cell-to-cell adhesion. PKD2KD and, to lesser extent, PKD1KD, strongly enhanced cell-to-cell adhesion of stable Panc89 cells, whereas E-Cadherin expression in the respective parental cell lines was reduced. At least in the case of PKD2KD cells, aggregation was only partially dependent on E-Cadherin, pointing to the expression of additional Cadherin isoforms. In the PKD2 expressing cell line, aggregation was very weak, in some assays even resembling the vector control. This phenotype could be correlated with processed E-Cadherin fragments in the supernatant of PKD2 expressing cells, which have been implicated in the literature with the inhibition of cell-to-cell adhesion of cancer cell lines, thereby also increasing their invasive potential. Initial results demonstrated that the E-Cadherin fragments from the supernatant of stable PKD2 expressing Panc89 cells were processed by a serine-protease, possibly Plasmin or cationic Trypsin. How the PKD2 isoform is implicated in this process remains to be investigated further. Yet, these findings are in line with data obtained from expression profiling experiments with the respective stable Panc89 cells, indicating that the urokinase-like Plasminogen-activator-receptor (PLAUR) is strongly up-regulated in PKD2 expressing cells, triggering the activation of the uPA-Plasminogen-Plasmin-cascade, which has been demonstrated to be involved in the processing of E-Cadherin. During the course of this work novel aspects concerning the role of PKD in cell migration and cellular adhesion were revealed. The localisation of PKD at the F-Actin cytoskeleton and its in vitro binding to F-Actin implicate possible functions for the PKD protein family in the regulation of F-Actin dynamics, which might influence cell adhesion and motility.
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The role of the deleted in liver cancer protein family in breast epithelial cell transformation
(2009) Holeiter, Gerlinde; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)
Three genes of the human genome encode for a subfamily of Rho GTPase-activating proteins (RhoGAPs) termed "deleted in liver cancer" (DLC) proteins. Rho GTPases participate in a complex set of intracellular signaling pathways including the regulation of cytoskeleton dynamics and cell motility. Since RhoGAPs accelerate the transfer of active GTP-bound Rho proteins to the inactive state, they are able to attenuate signal transduction activities of Rho GTPases. In vitro the DLC proteins show GAP activity towards the Rho proteins RhoA and Cdc42 but not for Rac1. DLC proteins have furthermore been identified as binding partners for tensin proteins and localize to focal adhesions. As the name implicates, loss of DLC protein expression has been first observed in hepatocellular carcinomas. Meanwhile, their down-regulation has also been found in a variety of other human cancers, indicating a possible role for the three DLC family members as tumor suppressors. Studies with overexpressed DLC1-3 suggest that they share common cellular functions. Ectopic expression of DLC1, for example, has been shown to inhibit cell migration, proliferation, anchorage independent growth and even metastasis. However, whether the loss of DLC family members is the cause of aberrant Rho signaling in transformed cells has not been investigated. To elucidate the functions of endogenous DLC proteins we silenced DLC1-3 expression in breast cancer cell lines using a RNA interference (RNAi) approach and compared the cellular alterations. We demonstrate that the loss of each DLC family member leads to a distinct cellular phenotype. For instance, knockdown of DLC1 and DLC3 enhanced cell motility in transwell assays, but had a differential impact on random cell migration and RhoA activity. By contrast, DLC2 down-regulation failed to affect cell locomotion, although it led to an enhanced level of active RhoA. Furthermore, we provide data supporting the involvement of DLC1 in the control of directed cell migration through a Dia1- and not Rho kinase (ROCK)-dependent pathway. In summary, we show that despite their overlapping substrate specificity towards RhoA in vitro, DLC family members have non-redundant cellular functions. We assume that this is most likely due to their multimodular structures, distinct spatial distributions and interaction with different signaling proteins in intact cells.