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Computergestützte Untersuchungen zur Dynamik und Wasserbindung des omega-loops in TEM beta-Lactamasen
(2007) Bös, Fabian; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Die Enzyme der TEM ß-Lactamasen stellen in gramnegativen Bakterien die Hauptursache für die Resistenz gegenüber ß-Lactam-Antibiotika dar. Der Omega-loop ist ein in allen Klasse A ß-Lactamasen konserviertes Strukturelement und positioniert eine für den Reaktionsmechanismus essentielle Aminosäure. Der Omega-loop ist durch eine Salzbrücke zwischen den Aminosäuren Arg164 und Asp179 in seiner Form fixiert. Der Grad seiner Flexibilität ist jedoch auf Grund teils widersprüchlicher Ergebnisse bisheriger Untersuchungen unklar. Da bekannt ist, dass Wasser einen großen Einfluss auf die Struktur, Funktion und Dynamik von Proteinen hat, wurde in dieser Arbeit mit computergestützten Methoden der Zusammenhang zwischen der Wasserbindung und der Dynamik des Omega-loops untersucht. Zudem wurde im Rahmen dieser Arbeit an der Automatisierung von multiplen molekulardynamischen Simulationen in Cluster- und Grid-Umgebungen sowie an neuen Methoden zur Analyse der Proteindynamik mitgearbeitet. Die Kristallwassermoleküle aus 49 hochaufgelösten Röntgenkristallstrukturen der ß-Lactamase-Familien TEM, SHV und CTX-M wurden einer Cluster-Analyse unterzogen, um Aussagen über konservierte Wassermoleküle in Klasse A ß-Lactamasen treffen zu können. Es wurden insgesamt 13 Wassermoleküle identifiziert, welche in mehr als 90% der 49 Strukturen konserviert waren; darunter auch zwei zu 100% konservierte Wassermoleküle. Sechs der insgesamt 13 konservierten Wassermoleküle waren am Omega-loop lokalisiert, drei weitere konservierte Wassermoleküle waren mit anderen loop-Elementen in der Proteinstruktur assoziiert. Die am Omega-loop lokalisierten Wassermoleküle befanden sich in einer Aushöhlung, welche der Omega-loop mit den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns formt. Diese konservierten Wassermoleküle ermöglichen die Ausbildung eines Wasserstoffbrückennetzwerks zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und denen des Proteinkerns und stabilisieren somit den Omega-loop. Um die Dynamik und Flexibilität des Omega-loops näher zu charakterisieren und den Einfluss der konservierten Wassermoleküle darauf zu untersuchen, wurden multiple molekulardynamische Simulationen der TEM ß-Lactamase in Wasser als explizitem Lösungsmittel durchgeführt. Es zeigte sich, dass die TEM ß-Lactamase ein hoch geordnetes und rigides Protein ist, dass nur in loop-Bereichen eine erhöhte Flexibilität aufweist. Während der Hauptteil des Omega-loops eine geringe Flexibilität aufweist, sind die Aminosäuren 173 bis 177 durch eine erhöhte Flexibilität gekennzeichnet. Dieses kurze Teilstück des Omega-loops zeigte eine deutliche Bewegung, die einem ¨Offnen und Schließen der Aushöhlung am Omega-loop entspricht. Durch die Kombination mehrerer Simulationen konnte auch gezeigt werden, dass die Ergebnisse früherer Arbeiten über die Flexibilität des Omega-loops keinesfalls im Widerspruch zueinander stehen, sondern jeweils nur unterschiedliche Teilschritte der Omega-loop Bewegung beschreiben, deren Gesamtdauer über die einer einzelnen Simulation hinausgeht. Für vier der sechs in der Kristallstrukturanalyse identifizierten konservierten Wassermoleküle konnte in den multiplen Simulationen reproduzierbar gezeigt werden, dass sie Wasserbrücken zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns ausbilden. Die Aminosäuren 173 bis 177 sind jedoch nicht an der Ausbildung dieser Wasserbrücken beteiligt, was ihre erhöhte Flexibilität erklärt. Die Durchführung multipler Simulationen stellt eine logistische Herausforderung in Bezug auf die Vorbereitung, Durchführung und Auswertung der zahlreichen Simulationen dar, die nur noch sehr schwer von Hand zu bewältigen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher in Zusammenarbeit mit dem Höchstleistungsrechenzentrum der Universität Stuttgart der gesamte Ablauf einer multiplen molekulardynamischen Simulation in ein System zur automatisierten Durchführung wissenschaftlicher Arbeitsabläufe implementiert und erfolgreich in einer Grid-Umgebung getestet. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Visualisierung und Interaktive Systeme der Universität Stuttgart wurde daher eine neuartige Methode zur haptischen Interaktion und Analyse von molekulardynamischen Simulationen entwickelt. Hierzu wurde ein haptisches Eingabegerät, dass Bewegungen in sechs Freiheitsgraden ermöglicht und über einen stiftähnlichen Griff bedient wird, mit einem Visualisierungsprogramm für molekulardynamische Simulationen gekoppelt. Dieser Ansatz ermöglicht durch das Zuweisen von Oberflächeneigenschaften an die betrachtete Proteinstruktur die Übermittlung zusätzliche Informationen. Zudem ist es möglich, über das haptische Eingabegerät direkt mit der Proteinstruktur zu interagieren und somit die Proteindynamik im Verlauf einer molekulardynamischen Simulation interaktiv und zeitabhängig zu analysieren.
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Cytochrom P450-Monooxygenasen : Modellierung, Datenbankanalyse und experimentelle Charakterisierung neuer Enzymvarianten
(2008) Seifert, Alexander; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Cytochrom P450-Monooxygenasen. Vertreter dieser Enzymsuperfamilie sind aufgrund ihrer Beteiligung am Medikamentenstoffwechsel des Menschen, sowie ihrer Fähigkeit eine Vielzahl chemischer Verbindungen stereo- und regioselektiv zu oxidieren Gegenstand intensiver Forschung. Die genaue Vorhersage des von P450-Monooxygenasen verursachten Medikamentenstoffwechsels ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Wirksubstanzen. Weiterhin sind einige Vertreter dieser Enzymsuperfamilie für biotechnologische Anwendungen interessant. Aufgrund ihrer hohen Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten, einem breiten Substratspektrum und relativer Prozessstabilität erweisen sich dabei Varianten der bakteriellen P450-Monooxygenase CYP102A1 (P450 BM-3) als besonders vielversprechend. Für die effiziente Anwendung von P450-Monooxygenasen ist jedoch häufig die Verbesserung bestimmter biochemischer Eigenschaften, wie der Regio-, Stereo- und Chemoselektivität unerlässlich. Eine wichtige Voraussetzung für die gezielte Verbesserung dieser Eigenschaften sowie für genaue Vorhersagen des von P450-Monooxygenasen verursachten Medikamentenstoffwechsels ist das Verständnis der molekularen Grundlagen von Aktivität, Spezifität und Selektivität. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit widmet sich daher der Untersuchung von Substrat-Enzym-Wechselwirkungen von Cytochrom P450-Monooxygenasen zur Identifizierung von selektivitätsbestimmenden Regionen. Hierzu wurde beispielhaft die Dynamik des CYP2C9-Warfarin-Komplexes mittels multipler molekulardynamischer Simulationen untersucht. Die Simulationsexperimente zeigten stark bewegliche Strukturelemente, welche die Bildung von Kanälen von der Proteinoberfläche ins Innere bewirken. Diese Kanäle ermöglichen den Austausch von Substraten und Produkten zwischen der Proteinumgebung und dem aktiven Zentrum. Die Beweglichkeit dieser Strukturelemente erlaubt darüber hinaus die Adaption des Enzyms an Substrate verschiedener Größe und Form. Die Regioselektivität wiederum wird durch einen engen trichterförmigen Hämzugangskanal kontrolliert, welcher vom starren Proteinkern gebildet wird. Dieser gewährt nur den Teilen des Substratmoleküls, die durch den Trichter passen, einen Zugang zum aktivierten Häm-Sauerstoff. Aminosäuren, die den Hämzugangskanal bilden, sind folglich von großer Bedeutung für die Orientierung des Substrats in der Nähe des Häms. Diese Erkenntnis führte zur Vorhersage von Aminosäuren mit starkem Einfluss auf die Regioselektivität in CYP2C9. Daraufhin wurden verschiedene P450-Monooxygenasen in dem für die Kontrolle der Regioselektivität wichtigen Bereich verglichen. Wegen ihrer direkten Nachbarschaft zu dem in der Sequenz und in der Struktur hoch konservierten ExxR-Motiv wurde die Region um die Substraterkennungsstelle 5 (SRS-5) für eine systematische Analyse von 31 Kristallstrukturen und über 6300 Sequenzen ausgewählt. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass P450-Monooxygenasen in dieser Region in Sequenz und Struktur variabel sind. Es wurde eine positiv geladene mit der Hämgruppe interagierende Aminosäure am C-terminalen Ende der SRS-5 Region in 29 Strukturen sowie in 97,7% aller Sequenzen identifiziert. Die Konformation der Region ist abhängig von der Position dieser Aminosäure nach dem konservierten ExxR-Motiv. Dabei zeigte sich, dass P450-Monooxygenasen hinsichtlich der Position dieser positiv geladenen Aminosäuren klassifiziert werden können. Die beobachteten Konformationen unterscheiden sich auch hinsichtlich der Position von zum Hämzentrum ausgerichteten Aminosäuren. Diese Aminosäuren beeinflussen die Orientierung von Substraten in der Nähe der Hämgruppe und haben damit einen starken Einfluss auf die Spezifität und Selektivität. Mit Hilfe der hier aufgeklärten Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehungen können solche Aminosäuren ausschließlich anhand der Proteinsequenz ohne Kenntnis der Proteinstruktur identifiziert werden. Dies erlaubte das Aufstellen von Regeln zur einfachen Identifizierung zweier Positionen mit großem Einfluss auf Spezifität und Selektivität nur anhand von Sequenzinformationen. Die Prädiktivität dieser Regeln wurde mit Hilfe experimenteller Literaturdaten bestätigt. Im letzten Teil der Arbeit wurden die bis dahin gewonnenen Erkenntnisse genutzt, um neue Varianten der für biotechnologische Prozesse vielversprechenden bakteriellen P450-Monooxygenase CYP102A1 zu generieren. Ziel war es hierbei die Regio, Stereo- und Chemoselektivität des Enzyms gegenüber verschiedenen Substraten zu erhöhen, sowie das Produktspektrum zu verändern. Zu diesem Zweck wurde eine Bibliothek von CYP102A1-Varianten erstellt, welche Mutationen in nur zwei Positionen aufweisen. Eine dieser Positionen wurde im Rahmen dieser Arbeit als hotspot für Selektivität und Spezifität identifiziert und kann in der Sequenz fast aller P450-Monooxygenasen lokalisiert werden. Die zweite Position wurde in vorangegangen Arbeiten als hotspot für Selektivität und Spezifität in CYP102A1 identifiziert. Durch Kombination von 5 hydrophoben Aminosäuren in beiden hotspot Positionen wurde eine Mutantenbibliothek minimaler Größe bestehend aus 24 Einfach- und Doppelmutanten generiert. Ziel war es dabei, kooperative Effekte von Mutationen in beiden hotspot Positionen zu induzieren, welche aufgrund der räumlichen Nähe beider Positionen erwartet wurden. Diese Mutantenbibliothek wurde mit vier Terpenen ((4R)-Limonen, (+)-Valencen, Nerylaceton und Geranylaceton) unterschiedlicher Größe und Form durchmustert. Nach der Entwicklung einer umfassenden Analytik zur Identifizierung der gebildeten Oxidationsprodukte konnte gezeigt werden, dass 11 Enzymvarianten ein verändertes Produktspektrum und/oder verbesserte Regio- und Stereoselektivität aufweisen. Zu den gebildeten Oxidationsprodukten gehört der wertvolle Aromastoff (+)-Nootkaton. Weiterhin werden hier erstmalig CYP102A1-Varianten vorgestellt, welche bevorzugt die 11- und 12-Hydroxyprodukte von Geranyl- und Nerylaceton produzieren. Dabei handelt es sich um wertvolle Ausgangsstoffe für die Synthese von Naturstoffen. Es zeigte sich, dass kooperative Effekte von Mutationen in beiden hotspots entscheidend für die Erhöhung der Selektivität von CYP102A1 gegenüber den sperrigeren Substraten (+)-Valencen und (4R)-Limonen sind.
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Data integration and data mining for the exploration of enzymatic sequence-structure-function relationships
(2018) Buchholz, Patrick C. F.; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
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Entwicklung und Anwendung einer flexiblen Dockingmethode für Enzyme und Substrate : Substrate-imprinted Docking
(2011) Juhl, Benjamin; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Die hier vorgestellte Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung einer flexiblen Dockingmethode für Enzyme und Substrate: Substrate-imprinted Docking. Die Methode wurde ausgehend von dem Programm FlexX entwickelt, mittels Literaturdaten evaluiert und dazu verwendet, Candida antarctica Lipase B Varianten mit veränderter Substratspezifität zu entwickeln, sowie experimentell beobachtete Substratspezifitäten auf molekularer Ebene zu erklären. Um die Anwendung dieser neuen Technik auf die Familie der alpha/beta-Hydrolasen zu unterstützen wurde die Lipase Engineering Database aktualisiert und erweitert.
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Modellierung der Adsorption von Proteinen an Oberflächen
(2009) Steudle, Alexander Patrick; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Die Adsorption von Proteinen an Oberflächen ist ein äußerst komplexer Prozess, der in vielen Bereichen, wie der Medizin, Pharmazie, Nanotechnologie und Biotechnologie, von großer Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Methoden zur Vorhersage der Orientierung und des Bindungsverhaltens von Proteinen bei der Adsorption entwickelt. Die Arbeit konzentrierte sich hierbei auf die Gebiete der Ionenaustauschchromatografie, der hydrophoben Interaktionschromatografie und der Immobilisierung. Als untersuchte Proteine wurden Hühnereiweiß-Lysozym, die Hämdomäne der bakteriellen Cytochrom P450-BM3 Monooxygenase und humane monoklonale Antikörper verwendet. Lysozym gehört zu den am besten charakterisierten und meisten analytisch verwendeten Proteinen, da es billig und in großen Mengen hergestellt werden kann. Viele bisherige Untersuchungen wurden mit Lysozym durchgeführt und die adsorbierte Orientierung auf Kationenaustauschern konnte experimentell bestimmt werden. Der Adsorptionsvorgang von Cytochrom P450-BM3 ist von Interesse bei Immobilisierungen, welche zu verbesserten Eigenschaften bei Betrieb und Lagerung sowie zu einer einfachen Separation des Produkts führen. Wichtig ist hierbei eine Orientierung des Enzyms mit freiliegendem Substratzugang. Auch bei der Bindung auf beschichteten Elektroden, durch welche sich die Möglichkeit der Entwicklung analytischer und biokatalytischer Anwendungen sowie eine einfache und billige Elektronenquelle ergibt, ist die Orientierung wichtig. Ebenso wie der Substratzugang ist hier die korrekte Orientierung des elektronenakzeptierenden Bereichs wichtig, da dieser mit der Elektrodenoberfläche in Kontakt stehen sollte. Antikörper gehören zu den am häufigsten eingesetzten therapeutischen Proteinen. Ihre Produktion ist teuer, da sie meist über Protein A aufgereinigt werden. Es besteht großes Interesse an billigeren alternativen Verfahren, wie der Ionenaustauschchromatografie. Früher wurden Adsorptionsprozesse meist mit vereinfachten Modellen eines Proteins, beispielweise als kugelförmiges Gebilde, modelliert. Durch die zunehmende Aufklärung der Proteinstrukturen in atomarer Auflösung wurden auch weiter entwickelte Adsorptionsmodelle erstellt, jedoch wurden Proteine dabei meist als unflexible Objekte modelliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es durch ein unflexibles Modell des Proteins, abhängig von der verwendeten Struktur und dem Abstand zur Oberfläche, bei der Modellierung von Adsorptionen zu Abweichungen von der experimentell bestimmten Orientierung kommen kann. Eine grobe Abschätzung der Bindungsorientierung ist bei einem kurzen Abstand aber noch möglich. Durch multiple Molekulardynamische Simulationen (MD-Simulationen), in welchen das Protein frei und flexibel an die Oberfläche binden konnte, hat sich am Beispiel Lysozym gezeigt, dass der Mittelwert der festgestellten gebundenen Orientierungen mit der experimentell bestimmten Orientierung, unabhängig von der zu Beginn verwendeten Proteinstruktur, übereinstimmte. Im Vergleich zeigten verschiedenen Proteine auch ein unterschiedliches Bindungsverhalten. Während bei Lysozym die Simulationen über einer negativ geladenen Oberfläche nur ein ähnliches Bindungsverhalten mit ähnlichen Bindungsorientierungen zeigte, erfolgte die Bindung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne auf einer positiv geladenen Oberfläche aufgrund ihres starken Dipolmoments immer in gleicher Weise und mit gleicher Orientierung. Die Orientierung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne in der frühen Phase der Bindung konnte auch mittels der rigiden Bestimmungsmethode festgestellt werden. Ein Kippen der kompletten Proteinstruktur nach dem ersten Kontakt zur Oberfläche wurde jedoch nur mittels MD-Simulationen vorhergesagt. Es konnte am Modell gezeigt werden, dass die adsorbierte Orientierung auf einer positiv geladenen Oberfläche zu einer Beeinträchtigung des Substratzugangs führt und, im Falle der Immobilisierung auf einer positiv geladenen Adsorberoberfläche, welche beispielsweise bei beschichteten Elektroden eingesetzt wird, eine ungünstige Ausgangsorientierung für die Elektronenübertragung vorliegt. Mittels MD-Simulationen der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne über verschiedenen Anionenaustauscherliganden konnte eine Korrelation der Bindungsenergien bei verschiedenen Salzkonzentrationen mit experimentell gemessenen chromatografischen Daten bestimmt werden. MD-Simulationen mit Antikörper waren durch die rechenintensiven, langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen Adsorber und Protein im Rahmen der zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten nicht durchführbar. Es konnten dennoch die Regionen, die bei der Aufreinigung mittels Ionenaustauschchromatografie Einfluss auf die Retention nehmen und somit für eine Optimierung des Proteins für den Aufreinigungsprozess infrage kommen, beispielsweise durch gezielte Mutationen in diesem Bereich, an der Proteinoberfläche mittels eines starren Modells bestimmt werden.
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Modellierung der Candida antarctica Lipase B unter nicht-natürlichen Bedingungen
(2015) Kulschewski, Tobias; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Candida antarctica Lipase B (CALB) ist ein für die Biokatalyse wichtiges Enzym, das für die Herstellung von Emulgatoren, Körperpflegeprodukten, Kosmetikartikeln, Geschmacksstoffen und Medikamenten verwendet wird. Allerdings wird diese Lipase durch einige organische Lösungsmittel wie z. B. Methanol bereits bei geringen Konzentrationen inaktiviert, während sie bei deutlich höheren Konzentrationen anderer organischer Lösungsmittel wie z. B. Ethanol noch aktiv ist. Dies ist ein Problem bei Reaktionen, bei denen Methanol als Substrat dient und in hohen Konzentrationen zugegeben wird. Im Zuge dieser Arbeit sollte der Einfluss von organischen Lösungsmitteln auf CALB sowie die Inaktivierung und der zugrunde liegende Mechanismus durch molekulardynamische Simulationen untersucht werden.
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Molecular modeling of hydrophobic effects in complex biomolecular systems : from simple mixtures to protein-interface aggregation
(2014) Benson, Sven P.; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Hydrophobicity is a term commonly used to discuss the formation of molecular structures in aqueous solution, and since water is ubiquitous in cellular systems, it may be applied in virtually every biomolecular context. Hydrophobicity is not a first-principle parameter but an abstract concept to describe the “behavior” of molecules in aqueous environments. The terminology of hydrophobicity is misleading, because it implies repulsion or a lack of attraction between nonpolar groups and water, when in fact attractive interactions persist due to atom dipoles. Although it has long been recognized that the driving force of structure formation in aqueous environments is founded in water’s “narcissism”, i.e., water self-preference, rather than in a general “fear of water”, the term hydrophobicity has established itself ever since Kautzmann related protein stability to hydrophobic interactions. Due to its false implications, hydrophobicity can be a cause of confusion and the culprit of misleading deductions. Presented in this dissertation is the author’s work on the structural and dynamical characterization of hydrophobic effects in biomolecular systems in the broadest sense, whereby molecular systems on three different size scales are covered: binary mixtures of methanol and water, aggregation of triglyceride droplets in aqueous solution and enzymes that interact with triglyceride-water interfaces of large-scale triglyceride aggregates.
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Strategies for rational protein engineering of cytochrome P450 monooxygenase systems
(2015) Gricman, Lukasz; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) constitute a large and diverse protein family. Because of their ability to introduce molecular oxygen into non-activated C-H bonds, CYPs are interesting enzymes for synthetic applications. However, stability, selectivity and activity are often obstacles prohibiting those enzymes from being used in industrial processes. Thus, novel protein engineering strategies for overcoming all those bottlenecks are required. In this work, a comprehensive guide to protein engineering of CYPs covering those three aspects was established to aid rational protein engineering of enzymes with and without known structure. The described protein engineering strategies are based on new insights into CYPs, which were gathered from incorporation of new functionalities into and analyses of the Cytochrome P450 Engineering Database (www.CYPED.BioCatNet.de), as well as molecular modeling of stereoselectivity in CYP101A1 from Pseudomonas putida. The described strategy for improving protein stability is based on the insights gathered from a systematic sequence-based protein stabilization of bovine adrenodoxin reductase. The presented strategies for protein engineering of selectivity are based on the identification of universal selectivity determining positions by systematic literature mining and on new insights from molecular modeling of stereoselectivity. The strategies for protein engineering of activity are based on the amino acid conservation analysis of CYPs, identification of the redox partner interaction sites, and a strategy for re-designing linker regions in artificial CYP fusion systems.
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Systematic analysis of the sequence-structure-function relationships of thiamine diphosphate-dependent enzymes
(2015) Vogel, Constantin; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes form a vast and diverse protein family, both in the sequence space and in their functional potential. Of particular interest are the enantioselective C-C bond forming and cleavage reactions catalyzed by those enzymes. In these reaction, different ThDP-dependent enzymes provide distinct enantio- and chemoselectivities with often narrow substrate and product ranges. This specificity, which is beneficial for the enantiopure synthesis of fine chemicals like 2-hydroxy ketones, limits the scope of accessible products. Investigations of crystal structures of different ThDP-dependent decarboxylases revealed steric properties in the active sites of those enzymes to control the enantio- and chemoselectivity (S-pocket and donor-acceptor concept). Subsequent application of those concepts by modulation of the steric properties of enzymes’ active sites enabled rational engineering of biocatalysts with desired, but often only moderate, non-physiological enantioselectivities. The major objective of this thesis was to systematically analyze the sequences and structures of this enzyme family and to elucidate the relationships between sequence, structure and function. Detailed understanding of those relationships is pivotal for rational engineering and therefore necessary for the design of biocatalysts with desired selectivities. As compared to the enormous size of this enzyme family only a small number of representatives were experimentally characterized. Even less ThDP-dependent enzymes were modified by mutations in order to analyze effects of distinct amino acid residues and still less were structurally determined. Since the systematic analysis of the sequence-structure-function relationships requires information on the structure and function of a major fraction of family members, methods were developed and applied to increase the amount of available structure and function information. By making use of homology modeling, putative atom coordinates for enzymes lacking experimentally determined structure information were predicted. In addition, by development of a new database system that combines sequence, structure and function information, the acquisition of accurate and comparable biochemical data unambiguously linked to the biocatalysts’ amino acid sequences was enabled. Comparability of biochemical data and deduction of functional roles of certain residues requires comparable biochemical data on the one hand and methods to compare residues from different enzymes on the other hand. Introduction of standard numbering schemes for ThDP-dependent enzymes facilitated fast and accurate comparison of structurally equivalent positions without the need for structure information. The findings derived from those analyses accelerated the engineering of enzymes with desired enantio- and chemoselectivities and inter alia enabled the enzymatic, direct asymmetric synthesis of (S)-benzoins with excellent ees.
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Von der Sequenz zur Funktion : systematische Modellierung verschiedener Proteinfamilien auf Sequenz- und Strukturebene
(2008) Knoll, Michael; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Das Verständnis der Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehung ist Voraussetzung, um experimentell beobachtete Unterschiede bei Enzymen hinsichtlich Selektivität und Substratspezifität erklären und verstehen zu können. Eine systematische Analyse der Enzyme innerhalb einer umfassenden Proteinfamilie verwandter Proteine ist zum Verständnis dieser Beziehung von Vorteil. Dadurch können in Sequenz und Struktur konservierte Bereiche aufgedeckt und familienspezifische Parameter abgeleitet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde am Beispiel von drei verschiedenen Proteinfamilien eine systematische Untersuchung der Proteinfamilie oder einzelner Vertreter durchgeführt, um familienspezifische Regeln aufzustellen und diese für das Proteindesign zu nutzen. Unterschiedliche Substratspezifitäten und Selektivitäten konnten mit einfachen Modellen beschrieben werden. Für zwei der Proteinfamilien wurden Proteinfamiliendatenbanken etabliert, die eine erweiterte und umfassendere systematische Analyse dieser Proteinfamilien ermöglichen. Für die Familie der Thiamindiphosphat-abhängigen Enzyme wurden systematische Strukturvergleiche verwandter Proteine durchgeführt, um Unterschiede bezüglich Selektivität und Substratspezifität zu erklären. Für die Familien der mittelkettigen Alkoholdehydrogenasen und der Cytochrom P450 Monooxygenasen wurden umfassende Proteinfamiliendatenbanken etabliert, die eine systematische Analyse dieser Familien ermöglichen.
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Vorhersage struktureller und biochemischer Eigenschaften von Cytochrom P450-Monooxygenasen und Laccasen
(2010) Sirim, Demetgül; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)
Durch die systematische Analyse von Proteinfamilien sollten familienspezifische Eigenschaften untersucht und erklärt werden. Die Sammlung der relevanten Daten aus den verfügbaren online-Ressourcen in einem konsistenten, nichtredundanten Datenbanksystem ermöglichte erst eine solche Analyse in sinnvollem Umfang. Daher wurden für die beiden industriell relevanten Enzymklassen Cytochrom P450-Monooxygenasen und Laccasen Proteinfamiliendatenbanken etabliert. Basierend auf der sinnvollen Einteilung in Unterfamilien, umfangreichen Annotationen und systematischen Analysen dieser Datenbanken, die sowohl Sequenz und Struktur umfassten, konnten strukturelle und biochemische Eigenschaften beschrieben werden. Die erlangten Erkenntnisse wurden zur Vorhersage derselben Eigenschaften in noch nicht kristallisierten Proteinen verwendet. Des Weiteren konnten experimentelle Phänomene durch die einfache Modellierung biochemischer Eigenschaften beschrieben werden.