Browsing by Author "Ragnitz, Kerstin"

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    Immobilisierung und Stabilisierung der Hydantoinase und L-N-Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens DSM 3747
    (2000) Ragnitz, Kerstin; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)
    Hydantoinase-Verfahren gewinnen zunehmend an Bedeutung für die Herstellung enantiomerenreiner Aminosäuren. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedlichste adsorptive und kovalente Methoden zur Immobilisierung einer Hydantoinase und L-N-Carbamoylase untersucht. Die Wildtypenzyme aus Arthrobacter aurescens wurden durch Zellaufschluß und Ammoniumsulfat-Fällung angereichert und nach Resuspendierung im geeigneten Puffersystem direkt immobilisiert. Allerdings konnten damit sowohl für die Hydantoinase als auch für die L-N-Carbamoylase nur geringe Aktivitäten erzielt werden, die zu gering waren, um industriellen Anforderungen gerecht zu werden. Mit der Bereitstellung der rekombinanten Enzyme war es möglich diese getrennt voneinander aufzureinigen, um den Einfluß unterschiedlicher Immobilisierungsparameter wie Protein-Träger-Verhältnis, Kopplungsmethode und Art des Trägermaterials systematisch zu untersuchen. Die Immobilisierung der L-N-Carbamoylase war nur über die Carboxylgruppen des Enzyms möglich, während die Oxiran-Methode zu einer Inaktivierung des Enzyms führte. Unter Verwendung eines hydrophilen Trägermaterials konnten Aktivitätsausbeuten von 100% und spezifische Aktivitäten bis zu 11 U/g Träger erzielt werden. Die rekombinante Hydantoinase ließ sich relativ problemlos mit spezifischen Aktivitäten von 3 U/g Träger sowohl an Epoxid- als auch an primäre Aminogruppen koppeln. Durch Lagerung in manganhaltigem Puffer war darüberhinaus eine Hyperaktivierung des Immobilisates um das 5-fache möglich. Alternativ zur kovalenten Kopplung der Enzyme wurde die Metallaffinitätschromatographie für die spezifische Bindung rekombinanter His6-tag Proteine direkt aus dem Rohextrakt untersucht. Die Ermittlung der Prozeßstabilität ergab Halbwertszeiten von 14000 h (Hydantoinase) bzw. 1000 h (L-N-Carbamoylase). Die pH- und Temperaturoptima waren für die immobilisierte Hydantoinase und L-N-Carbamoylase vergleichbar, so daß ein Einsatz unter denselben Reaktionsbedingungen möglich ist.