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CFD-Simulationen von Mischvorgaengen und biotechnischen Stoffumsetzungen in begasten Rührkesselreaktoren
(2001) Schmalzriedt, Sven; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
Rührkesselreaktoren kommen in zahlreichen chemischen und biotechnischen Produktionsprozessen zur Anwendung, für biotechnische Stoffumwandlungen sind sie sogar der wichtigste Standardapparat. Die Methoden der numerischen Strömungssimulation (Computational Fluid Dynamics, CFD) liefern heute die Grundlage für detaillierte Untersuchungen der lokalen und zeitabhängigen Vorgänge bei Stoffumsetzungen in der turbulenten Zweiphasenströmung im Rührkesselreaktor. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Methoden zum Einsatz von CFD-Simulationen bei der Analyse und Vorausberechnung biotechnischer Stoffumsetzungen in Rührkesselreaktoren entwickelt und auf exemplarische biotechnische Stoffumsetzungen angewendet. Bei der Modellierung wurde ein Mittelweg zwischen Komplexität und praktischer Anwendbarkeit gewählt, der auf der Entkopplung der Simulation von Fluiddynamik und Stoffumsetzungen beruht. Dadurch wurde die dynamische Simulation der Stoffbilanzen auf stationären Strömungsfeldern ermöglicht. Zunächst wurde das Durchmischungsverhalten in verschiedenen Reaktorkonfigurationen mit Einfach- und Mehrfachrührern anhand der Simulation von Pulsexperimenten untersucht. Simulationen der während der aeroben Fermentation von Saccharomyces cerevisiae auftretenden Substratverteilungen zeigen exemplarisch den erheblichen Einfluss der Konzentrationsgradienten auf das Ergebnis von im Zulaufverfahren durchgeführten Bioprozessen. Als Einflussfaktoren wurden die Rührerkombination im Mehrfachrührersystem sowie Rührerdrehzahl und Belüftungsrate betrachtet, wobei insbesondere die Wahl einer geeigneten Rührerkombination entscheidend ist. Es wird gezeigt, wie die unerwünschte Nebenproduktbildung durch die Berechnung eines optimalen Zulaufortes des Substrats minimiert werden kann. Zusätzlich wurden auf der Basis zweiphasiger, mit einem algebraic-slip-Ansatz berechneter Strömungsfelder die zugehörigen Verteilungen der Gelöstsauerstoffkonzentration simuliert.
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Entwicklung eines kontinuierlichen Verfahrens zur enzymkatalysierten Synthese eines strukturierten Triglycerides
(2005) Stadler, Hans-Gerhard; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Entwicklung eines kontinuierlichen Verfahrens zur Synthese des strukturierten Triglycerides 1,3-Oleyl-2-palmitoylglycerin war die von Schmid [Schmid 1999] entwickelte lipase-katalysierte Zwei-Schritt-Synthese für strukturierte Triglyceride vom Typ ABA [European Patent Application; EP 0 882 797 A2]. In der ersten Reaktionsstufe dieser zweistufigen Umesterung wird in einer Folgereaktion das Substrat Tripalmitin mit Hilfe einer Lipase über das Zwischenprodukt 1,2-Dipalmitin zum 2-Monopalmitin hydrolysiert, während in einer Parallelreaktion die freigesetzte Palmitinsäure mit Ethanol zum Palmitinsäureethylester umgesetzt wird. Die zweite Reaktionsstufe ist ebenfalls eine Folgereaktion, in der das Monopalmitin aus der ersten Reaktionsstufe mit Ölsäure, durch Einsatz der gleichen Lipase, über 1-Oleyl-2-palmitoylglycerin zu 1,3-Oleyl-2-palmitoylglycerin verestert wird. Voruntersuchungen ergaben eine optimale Reaktionstemperatur von 50°C und eine Vernachlässigbarkeit der Nebenproduktbildung. Die Parameter der reaktionskinetischen Ansätze wurden durch Variation der Edukt- bzw. Produktkonzentrationen unter Verwendung experimentell ermittelter Konzentrations-Zeit-Verläufe identifiziert. Die Evaluierung des Reaktionsmodells mittels Paritätsdiagramm und Residuen zeigte eine zufrieden stellende Übereinstimmung zwischen experimentellen Beobachtungen und berechneten Daten. Desweiteren zeigte die reaktionstechnische Untersuchung, daß vor der zweiten Reaktionsstufe der Produktstrom der ersten Reaktionsstufe aufkonzentriert, und das überschüssige Ethanol (Inhibierung des Enzyms) unter Rückhaltung des für die Aktivität des Enzyms notwendigen Wassers abgetrennt werden muß. Ferner ergab die Untersuchung der Monopalmitinumsetzung in der zweiten Stufe, daß eine Abtrennung des entstehenden Reaktionswassers aus dem Reaktionsgemisch (Gleichgewichtsverschiebung) während der Reaktion notwendig ist. Sowohl für die komplexe Trennaufgabe der Aufkonzentrierung des Produktstroms nach der ersten Reaktionsstufe, als auch für die Abtrennung des Reaktionswassers in der zweiten Reaktionsstufe wurde die Pervaporation eingesetzt. An den verwendeten Membranen wurden Stofftransportuntersuchungen (Variation von Feedkonzentration, Feedtemperatur und Permeatdruck) durchgeführt. Die experimentellen Ergebnisse der Stofftransportuntersuchungen wurden dazu verwendet, um für die eingesetzten Membranen die Parameter eines mathematischen Modells für die Pervaporation zu identifizieren. Neben den Trenneigenschaften der Membran ist deren Stabilität im Dauereinsatz ein wesentlicher Faktor für die Entscheidung über den Einsatz der Pervaporation in einer Produktionsanlage. Deshalb wurde für beide Membranen Untersuchungen des Standzeitverhaltens durchgeführt, die ausreichende Standzeiten von bis zu einem Jahr ohne Leistungsverlust ergaben. Nachdem die zur Verfahrensauslegung notwendigen Ergebnisse aus den reaktionstechnischen Untersuchungen und Stofftransportuntersuchungen vorlagen, wurde ein kontinuierliches Verfahren konzipiert und auf der Basis dieses Konzeptes anschließend das Verfahrensschema für eine kontinuierliche Miniplant entworfen. Für den kontinuierlichen Dauerbetrieb der Miniplant wurde die Versuchsanlage mit einem Prozeßleitsystem weitgehend automatisiert, daß alle ermittelten Temperaturen, Drücke und Massenströme in regelmäßigen Zeitabständen aufzeichnet und diese mit der zugehörigen Prozeßzeit in einem Prozeßprotokoll abspeichert. Die Auslegung und Konstruktion der Apparate des Verfahrens erfolgte auf Grundlage der gewonnenen Erkenntnisse aus den entsprechenden Untersuchungen. Nach Fertigstellung der Apparate erfolgte eine Charakterisierung hinsichtlich ihres Druckverlustes und Verweilzeit-verhaltens. Nach dem Aufbau der Miniplant und der erfolgreichen Inbetriebnahme erfolgten Untersuchungen zum Standzeitverhalten des immobilisierten Enzyms. Im Anschluß wurde eine Variation der verschiedenen Betriebsparameter durchgeführt und sowohl die Ergebnisse der stationären Zustände miteinander verglichen, als auch die dynamischen Übergänge zwischen den stationären Betriebspunkten untersucht. Zur Beschreibung sowohl der stationären Betriebszustände, als auch des dynamischen Verhaltens der Miniplant wurden dynamische Modelle der Grundoperationen für die kontinuierliche 1,3-Oleyl-2-palmitoylglycerin-Synthese unter Verwendung des kommerziellen Modellierungstools AspenCustomModeler (Aspen Technology Incorporated, USA) erstellt. Die Evaluierung dieser Modelle erfolgte durch Simulationen der Betriebsparametervariation und Vergleich mit den experimentellen Ergebnissen der stationären und instationären Betriebszustände. Umfassende Simulationen mit Hilfe des mathematischen Modells der 1,3-Oleyl-2-palmitoylglycerin-Synthese lieferten die Grundlage für eine Optimierung der Betriebs-parameter im Hinblick auf Maximierung der Produkt- und Raum-Zeit-Ausbeuten.
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Kinetic modelling of gene expression : from linear genome sequence to nonlinear cellular dynamics
(2003) Arnold, Sabine; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
In this study, a dynamic model of prokaryotic gene expression was developed that heavily makes use of gene sequence information. The main contribution arises from the fact that the combined gene expression model allows to assess mechanistically the impact of nucleotide sequence alteration on the dynamics of gene expression rates. Modelling required the development of a valid model structure for template-bound biopolymerization processes within a continuous analysis method. In contrast to a discrete model, or a combination of both approaches (i.e., hybrid modelling), the continuous model presented is a mechanism-based deterministic description of system states in terms of differential and algebraic sets of equations. Characteristically, a codon-specific representation of state variables was chosen for this model. Transcription kinetics were described mathematically at the example of T7 RNA polymerase. Parametrization of the transcription model was carried out for selected model constants, i.e., for the rate constants of initiation, elongation, and termination, as well as for the maximum rate of transcription. According to enzyme kinetics, most influential parameters determining transcription rate are T7 RNA polymerase concentration, and promoter concentration at typical reaction conditions of simultaneous in vitro transcription/translation. The process of mRNA degradation was modelled allowing for a distinction between endonucleolytic and exonucleolytic reaction steps. The effects of increased translational efficiency greatly improving mRNA stability, as observed experimentally, were correctly demonstrated by the model. On the basis of simulating lacZ mRNA degradation, it was possible to identify the parameters contained in the degradation model. The translation model presented covers the mechanisms of protein synthesis initiation, elongation, and termination, at the same time considering the particular mechanistic role of key translation factors. An earlier approach for describing sterical interference among template-bound catalysts (MacDonald et al., 1968) was extended in this study, in order to cover also a situation where two different types of catalysts (i.e., ribosomes and degradosome) can be bound in multiple copies to a same template. The number of state variables could be significantly diminished by merging groups of base tripletts together (model reduction), while at the same time taking into account the implications on reaction kinetics and material balancing. The current status of the combined model allows to reveal several causes for production limitation, whether they are due to substrate depletion or inactivation processes, or else caused by unfavourable initial catalyst concentrations and their stoichiometric relations. An application of the combined gene expression model to simulating cell-free protein synthesis dynamics demonstrated limited volumetric productivitites to be caused by unfavourably low translation factor levels that are typical for these dilute in vitro systems. Equilibrium binding calculations suggested a requirement for at minimum equal molar ratios of initation factors IF1, IF2, and IF3, with respect to total concentration of unbound ribosomes. By appropriately raising the concentrations of both translation initiation and elongation factors, a 4-fold improvement of volumetric protein synthesis rate and a 5-fold higher final product yield are predicted in comparison to a non-optimized reference batch process. From a stand-point of reduced model complexity, it may be beneficial to use the overall model for estimation of mechanism-related parameters or decay constants of a gene expression model, prior to applying these parameters within a whole-systems modelling frame. The immediate value of such models arises from their applicability for describing the expression of individual genes or a few genes at a time, which are typical for recombinant protein production. Gene sequence information enters the overall model at the following stages: (a) within the transcription process, by assigning different rate constants for initiation and termination of mRNA synthesis, respectively, (b) the endo- and exonuclease activities in the ordered process of 5' to 3'-degradation of messenger RNA, (c) during translation by distinguishing codon-specific elongation rates and effects related to sterical interactions among translating ribosomes. An attempt was made also to investigate the impact of predicted mRNA secondary structure within the ribosome binding site on measured translation rate. The results of this analysis suggest improved protein synthesis rates for mRNA conformations that favour a high degree of single-strandedness within a region of approximately 20 nucleotides downstream of the Shine-Dalgarno sequence. Coincidently, this mRNA region is covered by the ribosome during the event of ribosome binding.
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Modellgestützte Analyse der Dynamik des Phosphofructokinase-Systems in Saccharomyces cerevisiae
(2000) Vaseghi, Sam; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
In der vorliegenden Arbeit wird das Phosphofructokinase-1 und -2-System in S. cerevisiae hinsichtlich seiner dynamischen Eigenschaften unter in-vivo Bedingungen untersucht. Hierzu wurden glucoselimitierte kontinuierliche Kulturen von Saccharomyces cerevisiae durch das Auftragen eines extrazellulären Glucosepulses im stationären Zustand angeregt. In Antwort auf eine solche Anregung wurden Veränderungen der intrazellulären Metabolitkonzentrationen bzw. Enzymaktivitäten beobachtet, welche anhand modellgestützter Untersuchungen die Erfassung dynamischer Eigenschaften des betreffenden reaktionskinetischen Systems unter in-vivo Bedingungen ermöglichen. Nachweislich unterliegt Phosphofructokinase-1 im Cytosol den homologen und heterologen Protein-Protein-Wechselwirkungen. Durch diese Wechselwirkungen werden kinetische Eigenschaften des Enzyms signifikant beeinflußt. Es konnte gezeigt werden, daß die Phosphofructokinase-1 unter in-vivo Bedingungen nur vom positiven Effektor Fructose-2,6-bisphosphat (zu Signaltransduktionsebene) bzw. dem negativen Effektor MgATP (zum Energiestatus) beeinflußt wird. Die Phosphofructokinase-2 ist unter in-vivo Bedingungen durch die Substrate Fructose-6-phosphat und MgATP gesättigt. Ihre Aktivierung erfolgt somit ausschließlich über eine Phosphorylierung durch Proteinkinase-A. Die Übertragung des cAMP Signals auf die Phosphofructokinase-2 weist zwei charakteristische Eigenschaften auf: Zum einen liegt bei dieser Übertragung ein positiver Feed-back-Mechanismus vor zum zweiten weist die Übertragung des Signals über Proteinkinase-A ausgeprägte Hytereseeigenschaften auf. Demnach wird die Proteinkinase-A mit ansteigenden cAMP-Konzentrationen erst beim Erreichen einer kritischen Konzentration aktiviert. Danach nimmt die Signalübertragung seinen eigenen Lauf unabhängig vom weiteren Verlauf der Konzentration des cAMP. Dies ermöglicht der Zelle eine Autonomie und Entkopplung der Phosphofructokinase-2 Aktivität vom Eingangssignal des cAMP.
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Modellgestützte Entwicklung eines mehrstufigen Verfahrens zur enzymatischen Synthese enantiomerenreiner Aminosäuren
(2008) Teves, Harald; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vollständigen Verfahrens zur Synthese von enantiomerenreinen L-Aminosäuren durch Biotransformation mit immobilisierten Enzymen. Als Modellsystem wurde die zweistufige Hydrolyse von D,L-Benzylhydantoin über L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin gewählt. Die erste Stufe wurde durch das enantioselektive Enzym Hydantoinase katalysiert und die zweite durch das enantiospezifische Enzym L-Carbamoylase. Ein Schwerpunkt war die Analyse und Modellierung des gegebenen Reaktionssystems, das die reversible Reaktion von D- bzw. L-Benzylhydantoin zu D- und L-Caramoylphenylalanin, die irreversible Reaktion von L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin sowie die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin umfasste. Die Parameter in den enzymkinetischen Gleichungen wurden aus Anfangsreaktionsraten und zeitlichen Konzentrationsverläufen abgeschätzt. Da in einer Versuchsanlage an poröse Partikel immobilisierte Enzyme Verwendung fanden, wurden die enzymkinetischen Modelle um Gleichungen für den externen Transport der Reaktanten an die Partikeloberfläche und den internen Transport in den Partikeln erweitert. Die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin wurde mit zwei Modellen beschrieben, die sich in ihrem Detaillierungsgrad unterschieden. Während das erste Modell die Dissoziation des Benzylhydantoins berücksichtigte und die basenkatalysierte Racemisierung in wässriger Lösung von der Racemisierung an einem Ionenaustauscher differenzierte, vereinigte das zweite Modell die verschiedenen Mechanismen zu einer reversiblen Reaktion mit Hin- und Rückreaktion jeweils pseudo-erster Ordnung. Wichtigstes Ergebnis des detaillierten Modells war die Beschleunigung der Racemisierung durch Verschiebung des pH-Werts, wobei der durch Katalyse am Ionenaustauscher erzielte Geschwindigkeitszuwachs im Vergleich zur spontanen Reaktion exponentiell anstieg. Auf der reaktionstechnischen Analyse bauten die Gestaltung einer Versuchsanlage im Labormaßstab und die Erstellung eines mathematischen Prozessmodells dieser Versuchsanlage auf. Mit Rücksicht auf die begrenzte Aktivität der Enzymimmobilisate und die geringe Löslichkeit des Benzylhydantoins wurde das Verfahren, welches drei Operationen umfasste, absatzweise betrieben: Auflösung von D,L-Benzylhydantoin in einem gerührten Membranreaktor, zweistufige enzymatische L-Phenylalanin Synthese in einem Festbettreaktor mit immobilisierter Hydantoinase und L-Carbamoylase sowie Racemisierung des nicht abreagierten Substrats D-Benzylhydantoin in einem zweiten mit starkem Anionenaustauscher gefüllten Festbettreaktor. Alle drei Apparate waren hintereinandergeschaltet und bildeten einen geschlossenen Kreislauf. Optional erfolgte eine nachgeschaltete Aufreinigung des Produkts L-Phenylalanin durch Elektrodialyse. Im Vorfeld zu den experimentellen Arbeiten an der Versuchsanlage - und später auch diese begleitend - wurde ein mathematisches Modell des gesamten Verfahrens erstellt und mit Versuchsdaten parametriert. Dieses Modell bildete die Auflösung von festem Benzylhydantoin in einem ideal durchmischten Membranreaktor, die enzymatische Umsetzung im ersten und anschließende Racemisierung im zweiten Festbettreaktor sowie die Rückführung in den Membranreaktor ab. Bezüglich der Festbettreaktoren wurden die Stoffbilanzen getrennt für das Hohlraumvolumen sowie die porösen Partikel der Schüttung aufgestellt. Verkoppelt waren sie durch den Stoffübergang an der Oberfläche eines jeden Partikels. In den porösen Partikeln katalysierten die an der inneren Oberfläche immobilisierten Enzyme die im vorangehenden beschriebenen Reaktionen. Es resultierten hauptsächlich partielle Differentialgleichungen, die mit einem finite Volumen Verfahren (TVD) örtlich diskretisiert und dem numerischen Integrator LIMEX gelöst wurden. Da die vollständige Umsetzung des racemischen Substrats D,L-Benzylhydantoin zum enantiomerenreinen Produkt L-Phenylalanin wesentlich von der Racemisierung abhing, kam dieser Umlagerungsreaktion eine zentrale Bedeutung zu. Es zeigte sich, dass eine Steigerung der Produktausbeute eine überproportionale Erhöhung der Ionenaustauschermasse erforderte. Andererseits bedeutete die Erhöhung der Ionenaustauschermasse einen zunehmenden Verlust an Produkt, da es durch Bindung an den Ionenaustauscher in der Reaktionslösung abgereichert wurde. Bezüglich des theoretisch möglichen Enantiomerenüberschusses von 100 % bei vollständiger Umsetzung des racemischen Substrats erwies sich beim gegebenen pH-Wert auch mit maximaler Racemisierungsgeschwindigkeit die langsame Rückreaktion von D-Carbamoylphenylalanin zu D-Benzylhydantoin als limitierend, und es resultierte ein maximaler Enantiomerenüberschuss von 64 %. Simulationsergebnisse belegten den vernachlässigbaren Einfluss der Auflösungskinetik des Benzylhydantoins auf das Gesamtgeschehen.
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Proteomics und molekularbiologische Analyse der zellfreien Proteinbiosynthese
(2000) Schindler, Petra T.; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe bioanalytischer Methoden und Proteomanalysen eine eingehende Diagnose der Limitationen der zellfreien Proteinbiosynthese durchzuführen. Bei den Untersuchungen wurden ausschliesslich S30 Zellextrakte von Escherichia coli eingesetzt. Langfristiges Ziel soll dabei die Therapie der identifizierten Begrenzungen der in vitro Biosynthese sein, um schliesslich die Produktkonzentrationen und Raum-Zeitausbeuten für die synthetisierten Proteine zu verbessern. Durch quantitative Analysen wurde gezeigt, dass die Energieversorgung der zellfreien Biosynthese durch das Energieregenerierungssystem von Acetatkinase/Acetylphosphat nicht limitierend für die Proteinbiosynthese ist. Mit hochauflösender zweidimensionaler Elektrophorese (2DE) plus Sequenzanalysen konnten Elongationsfaktoren und ribosomale Proteine identifiziert werden, jedoch lagen diese essentiellen Proteine im Verlauf der Proteinbiosynthese zum Teil in unterschiedlichen Isoformen vor. Offensichtlich stehen also Zustandsänderungen der Lysatproteine im Zusammenhang mit der Translationsaktivität eines zellfreien Lysates. So wurde festgestellt, dass sich das Phosphorylierungsmuster mit der translationalen Aktivität des zellfreien Lysates ändert. In inaktiven Lysaten konnten kaum Modifizierungen dieser Art gefunden werden, während in aktiven Lysaten essentielle Proteine phosphoryliert waren. Zeitgleich mit dem Zusammenbruch der zellfreien Synthese im Batch-Verfahren haben die meisten dieser Proteine ihre Modifikation verloren. Allein von EF-Tu war bisher bekannt, dass eine Phosphorylierung an Threonin 382 essentiell ist. Aufgrund weiterer Messungen konnte ausgeschlossen werden, dass die Energie- oder Substratversorgung des zellfreien Systems sowie die Transkription den Zusammenbruch nach 50min Batch-Reaktion herbeiführen. Als die Biosynthese potentiell limitierender Faktor zeigte sich die Änderung des Modifizierungsmusters der Lysatproteine und damit der vorhandenen Aktivität und Funktion.
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Verknüpfung molekularphysiologischer und reaktionskinetischer Werkzeuge zum Studium der in vivo Regulation des Glukosetransports von Saccharomyces cerevisiae
(2003) Buziol, Stefan; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)
In der vorliegenden Arbeit wurde der Glukosetransport von Saccharomyces cerevsisiae auf reaktionskinetischer und molekularphysiologischer Ebene untersucht. Der Transport von Hexosen beruht bei S. cerevisiae auf dem Prozess der carriervermittelten erleichterten Diffusion. Durch die Expression geeigneter Transportproteine aus einem Set von 20 Genen kann sich die Zelle auf die Umgebungsbedingungen einstellen. Zunächst wurden die kinetischen Parameter für die Transportproteine Hxt1, Hxt5 und Hxt7 anhand von Einzelexpressionsmutanten in vivo geschätzt. Zusätzlich wurde der Wildtyp charakterisiert. Durch den Einsatz der aeroben fed-batch Kultivierung wurde der quasi-stationäre Zustand, der die Grundvoraussetzung für diese Untersuchungen ist, im Gegensatz zum steady-state bei Chemostat-Kultivierung nach kürzerer Zeit erreicht. Ausgehend von Zellpopulationen unter physiologisch definiertem Zustand wurden Glukosepulsversuche durchgeführt, und die Abnahme der extrazellulären Glukose verfolgt. Dieses Signal wurde mit dem Resultat einer numerischen Integration der dynamischen Bilanzgleichung verglichen, um unter Verwendung einer irreversiblen Michaelis-Menten Kinetik die kinetischen Parameter für die Einzelexpressionsmutanten und den Wildtyp abzuschätzen. Um den Transportschritt vollständig beschreiben zu können, ist es nötig, die Konzentrationen von intrazellulärer Glukose und Glukose-6-Phosphat (G6P) miteinzubeziehen. Es ist hierbei von Bedeutung, die initiale Aufnahmerate zu erfassen, da es während der Glukoseaufnahmemessungen zu einem Anstau intrazellulärer Glukose und infolgedessen einem Efflux derselben kommen kann. Dieser Efflux überlagert dann die Aufnahmemessungen. Während für die Messung von G6P geeignete Zellaufschluss und Extraktionsverfahren zur Verfügung standen, musste zur Erfassung des Signals intrazellulärer Glukose eine neue Methode entwickelt werden. Durch die Etablierung einer stopped-flow Probenahmetechnik wurde es möglich, die Dynamik der Konzentrationen intrazellulärer Glukose und von G6P im Millisekundenbereich zu erfassen. Die experimentellen Daten für die Dynamik von intrazellulärer Glukose und G6P können nun eingesetzt werden um ein Modell des Glukosetransports zu validieren, das auf einer reversiblen Influx-Efflux Kinetik basiert und eine Inhibition durch G6P berücksichtigt. In weiteren Untersuchungen wurde durch den Einsatz von Western blot Analysen die Dynamik der Hexosetransportproteine (Hxt1, Hxt5 und Hxt7) parallel als Antwort auf Veränderungen in der Glukosekonzentration verfolgt. Die gemessenen Konzentrationen für extrazelluläre Gukose, Ethanol und Biomasse wurden mittels Western blot Analyse mit der Expression der Transportproteine korreliert. Zuerst wurde eine glukoselimitierte Chemostat-Kultivierung auf einen batch-Prozess unter Glukoseüberschuss umgeschaltet. Dabei wurde eine Reprimierung des intermediäraffinen Hxt5-Proteins und eine Induktion von Hxt1, dem niedrigaffinen Transporter beobachtet. Die Expression des hochaffinen Hxt7-Transporters wird nach dem Umschalten zunächst verstärkt, um dann stark abzunehmen. Dies könnte einen Mechanismus der Zelle darstellen, auf die erhöhten Glukosekonzentrationen schnell zu reagieren. Beim zweiten Ansatz wurde eine Chemostat-Kultur durch multiple Glukosepulse dynamisch angeregt. Es konnte kein Einfluss der multiplen Stimuli auf die Expression der Transporter Hxt1 und Hxt5 nachgewiesen werden. Hxt7 hingegen zeigte deutliche Änderungen im Expressionsprofil. Es wurde eine Korrelation zwischen der Expression von Hxt7 und den spezifischen Raten für die Glukoseaufnahme und die Ethanolbildung beobachtet. Die Anwendung des Konzepts der "Metabolic control analysis" (Sensitivitätsanalyse) auf ein dynamisches Modell zur Beschreibung des anaeroben Wachstums von S. cerevisiae zeigte, dass die überwiegende Kontrolle des glycolytischen Flusses auf dem Transportschritt liegt. Somit sollte eine Erhöhung der Transportkapazität zu einem höheren glycolytischen Fluss führen. Unter Verwendung einer HXT5-Überexpressionsmutante (HXT5-Multicopyplasmid), der HXT5-Einzelexpressionsmutante sowie des Wildtyps wurden vergleichende Messungen des glycolytischen Flusses durchgeführt. Dazu wurden anaerobe Chemostat-Kulturen eingesetzt und die spezifischen Glukoseaufnahme- und Ethanolbildungsraten gemessen. Die Erhöhung der spezifischen Raten war unbefriedigend. Dies könnte an der durch die Überexpression verursachten "protein burden" liegen oder das Resultat von stark veränderten Poolkonzentrationen sein. Somit sollte ein zukünftiger Ansatz zur Steigerung der glycolytischen Leistung die Minimierung des "protein burden" sowie die Aufrechterhaltung der Homöostase berücksichtigen. Wie sich aus weiteren Simulationsergebnissen ergab, müssen dabei auch Enzyme berücksichtigt werden, die der Erhöhung der Poolkonzentrationen entgegenwirken.