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Open Access
Entwicklung eines DNA-Microarrays zur Detektion von Resistenzdeterminanten in Acinetobacter baumannii
(2014) Dally, Simon; Rupp, Steffen (PD Dr.)
Acinetobacter baumannii ist ein opportunistisch pathogenes Bakterium, welches schwere Infektionen, insbesondere Pneumonie, Sepsis, Harnwegs- oder Wundinfekte, auslösen kann. Es besitzt die Fähigkeit, in beachtlichem Ausmaß, Antibiotika-Resistenzen zu akquirieren, was die Behandlung infizierter Patienten erheblich erschwert. Erst nach der Detektion dieser Resistenzen lässt sich eine gezielte antibiotische Therapie initiieren. In dieser Arbeit wurde ein DNA-Microarray entwickelt, der die Diagnose von Resistenzdeterminanten in A. baumannii ermöglicht. Der Zeitbedarf für die Arrayanalyse lag mit 4 Stunden dabei deutlich unter dem für konventionelle kulturbasierte Methoden. Der neu entworfene Microarray ist mit seinen 370 speziell entwickelten Sonden dazu in der Lage, 91 Zielsequenzen, die mit einer Antibiotika-Resistenz assoziiert sind, nachzuweisen. Die kurze Bearbeitungszeit, die für eine Analyse veranschlagt werden muss, gewährt die schnelle Verfügbarkeit therapierelevanter Resultate. Damit ist eine schnelle Anpassung der Medikation kritisch erkrankter Patienten und konsekutiv eine Verbesserung ihrer Prognose möglich. Auch zur Aufklärung epidemiologischer Fragestellungen könnte der Microarray eingesetzt werden.
Open Access
Erweiterung des genetischen Codes von Candida albicans zur Analyse von Protein-Protein Interaktionen in vivo
(2014) Grumaz, Silke; Rupp, Steffen (PD Dr.)
In der vorliegenden Arbeit wurde der genetische Code des humanpathogenen Pilzes Candida albicans durch gezielte Etablierung und Optimierung eines orthogonalen Pärchens bestehend aus tRNA und tRNA-Synthetase um die synthetische Aminosäure p-Azidophenylalanin erweitert. Nach Integration der synthetischen Aminosäure in vivo und UV-Bestrahlung war eine positionsspezifische Kreuzvernetzung binärer Protein-Protein Interaktionen möglich, wie anhand von zwei Modellproteinen gezeigt werden konnte. Diese kreuzvernetzten Proteinkomplexe konnten zudem aufgereinigt und massenspektrometrisch analysiert werden, was eine generelle Eignung der Methode für die Indentifizierung auch unbekannter Interaktionen zeigte. Somit konnte ein wirkungsvolles Werkzeug für die Candida-Forschung etabliert werden.
Open Access
Etablierung von Methoden zur Studie von molekularen Wechselwirkungen in S. cerevisiae basierend auf dem erweiterten genetischen Code
(2013) Berg, Michael; Rupp, Steffen (PD Dr.)
Zahlreiche Methoden zur Studie von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen wurden bereits etabliert. Jedoch fehlt es an Methoden, welche die Wechselwirkungen hoch aufgelöst und zugleich im natürlichen Kontext beschreiben. Eine neue Möglichkeit für die Entwicklung neuer Ansätze bietet der erweiterte genetische Code. Hierbei werden nicht-kanonische Aminosäuren mit neuen physikalisch-chemischen Eigenschaften an definierte Positionen in Proteine in vivo eingebaut. In dieser Arbeit wurden unter Verwendung des erweiterten genetischen Codes und den photoreaktiven nicht-kanonischen Aminosäuren p-Azidophenylalanin sowie p-Benzoyl-phenylalanin Ansätze für die Erforschung von Protein-DNA- und Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo entwickelt. Hierbei wurden beide nicht-kanonischen Aminosäuren positionsspezifisch mithilfe einer orthogonalen tRNA sowie der entsprechenden orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase aus E. coli in die Modellproteine eingebaut. Zugleich wurde auch die Wirkung der orthogonalen Komponenten des erweiterten genetischen Codes auf den hier verwendeten Modellorganismus S. cerevisiae analysiert. Für die Etablierung einer Methode zur Studie von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurde das Co-Chaperon Aha1 als Modellprotein verwendet. Dabei wurde eine zuvor in der Literatur beschrieben Bindedomäne zu Hsp90 untersucht. An acht unterschiedliche Positionen in der Bindedomäne wurde p-Azidophenylalanin eingebaut und eine Interaktion dieser mutagenisierten Aha1-Proteine zu Hsp90 mittels einer nativen Co-Immunpräzipitation bestätigt. Anders als ursprünglich erwartet, wurde durch die Belichtung mit UV-Licht jedoch kein Heterodimer bestehend aus Hsp90 und Aha1, sondern ein Homodimer bestehend aus zwei Aha1-Monomeren quervernetzt und massenspektrometrisch identifiziert. Die Ausbildung des quervernetzten Homodimers war nur in Abhängigkeit von UV-Licht, von der genauen Einbauposition der nicht-kanonischen Aminosäure im Protein und der Zugabe der nicht-kanonischen Aminosäure möglich. Dieses Homodimer konnte auch mit einer weiteren photoreaktiven nicht-kanonischen Aminosäure p-Benzoylphenylalanin bestätigt werden. Mit der in dieser Arbeit etablierten Methode konnte eine zuvor in vitro beschriebene Bindedomäne von Aha1 zu Hsp90 nicht bestätigt werden. Stattdessen konnte gezeigt werden, dass diese Bindedomäne bei der Ausbildung von Homodimeren in vivo eine Rolle spielt. Für die Etablierung einer Methode zur Studie von Protein-DNA-Wechselwirkungen wurde der Transkriptionsfaktor Gal4 als Modellprotein verwendet. Gal4 konnte in Abhängigkeit von p-Azidophenylalanin mit der spezifischen GAL7-Promotersequenz quervernetzt und dieser Protein-DNA-Komplex deutlich angereichert werden. Allerdings hat sich Gal4 im Laufe der Experimente als ungeeignet für die Etablierung eines globalen Ansatzes zur Charakterisierung aller Gal4-DNA-Bindestellen herausgestellt, da es bei Überexpression eine toxische Wirkung auf die Zellen zeigte. Zusammengefasst zeigt sich, dass der erweiterte genetische Code einen vielversprechenden Ansatz bietet, um Protein-Protein aber auch Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu studieren.
Open Access
Identifizierung und vergleichende Charakterisierung eines zentralen Regulationsfaktors der Morphogenese und des Stickstoffmetabolismus in humanpathogenen Pilzen
(2012) Lindemann, Elena; Rupp, Steffen (PD Dr.)
Von den etwa 200 verschiedenen Pilzen der Hefegattung Candida gilt insbesondere Candida albicans als der medizinisch bedeutendste Hefepilz, da er als fakultativ pathogener Erreger zwar bei 75% der Bevölkerung hauptsächlich den Gastrointestinaltrakt symptomlos besiedelt, jedoch bei immunsupprimierten Patienten über zwei Drittel aller invasiven, systemischen Infektionen auslöst, die eine Mortalitätsrate von über 30% aufweisen. Mit der Identifizierung von Candida dubliniensis wurde ein sehr naher Verwandter von C. albicans beschrieben, der trotz einer sehr engen phylogenetischen Verwandtschaft und ähnlichen phänotypischen Eigenschaften, in epidemiologischen Studien eine nur sehr geringe Prävalenz sowie eine deutlich reduzierte Virulenz aufweist. Ein Vergleich beider Candida-Spezies sollte daher die Grundlage bieten, Unterschiede zwischen den beiden Hefepilzen zu identifizieren, die zur verbesserten Adaptation von C. albicans gegenüber C. dubliniensis an den Wirtsorganismus führen und zu ihrer unterschiedlichen Pathogenität beitragen. Durch eine vergleichende Analyse der beiden Candida-Arten insbesondere im Hinblick auf ihre unterschiedliche Induktion und Regulation von morphologischen Differenzierungsprozessen (z. B. der Transition von der sphärischen Blastopore zur filamentösen Wachstumsform, die in C. albicans als ein wichtige Virulenzfaktor angesehen wird) wurde in dieser Arbeit ein zentraler Morphogeneseregulator in C. dubliniensis identifiziert, der signifikante Homologien zu einer konservierten Klasse von Transkriptionsfaktoren in Pilzen aufweist, die als APSES-Proteine bezeichnet werden. Die Deletion dieses Gens und nachfolgende funktionelle Charakterisierung konnte zeigen, dass die Deletionsstämme neben einer veränderten Morphologie sich in der Induktion des hyphalen Wachstums und der Chlamydosporen-Ausbildung vom Wildtypstamm deutlich unterschieden. Aufgrund dieser Funktion als zentraler Morphogeneseregulator wurde das entsprechende Protein als Mom1 - „Modulator of Morphogenesis 1“ bezeichnet. Weiterführende Analysen konnten zeigen, dass MOM1 außerdem einen großen Einfluss auf das Adhäsions- und Invasionsverhalten sowie den Zellwandaufbau der Zellen hat. Diese Eigenschaften sind vergleichbar mit der Funktion des Efg1p in C. albicans. Durch die ektopische Expression von MOM1 im efg1Δ-Deletionsstamm oder die heterologe Integration von EFG1 in den mom1Δ-Deletionsstamm konnte der morphologische Phänotyp sowie die Defekte in der Zellwandzusammensetzung funktionell komplementiert werden. Durch differenzielle Genexpressionsstudien von Wildtyp- und Deletionsstämmen unter zwei unterschiedlichen Wachstumsbedingungen mithilfe der ebenfalls in dieser Arbeit etablierten und validierten MESSAGE-Technologie, die auf einer hochauflösenden zweidimensionalen Auftrennung der ds-cDNA-Fragmente basiert, konnte außerdem gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Mom1p - ähnlich wie Efg1p aus C. albicans- neben den Proteinen der Zellwand oder Zellmembran auch zahlreiche metabolische Prozesse reguliert. Je nach Bedingung wurden durch Deletionen von MOM1 zahlreiche Gene z. B. der Ribosomenbiogenese oder des Kohlenhydrat-metabolismus differentiell exprimiert. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal auch eine konservierte Funktion der APSES-Proteine Mom1p und Efg1p im Stickstoffmetabolismus beschrieben werden. Beide Proteine scheinen dabei eine essentielle Rolle als Schalterproteine spielen, ob nieder- oder hochmolekulare Stickstoffquellen für den Wachstumsprozess verwertet werden. Trotz der konservierten Funktion zeigten sich zwischen beiden Candida-Arten signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation dieser APSES-Gene. So wurden MOM1 und EFG1 in den entsprechenden Wildtyp-Stämmen unter zahlreichen Bedingungen und unabhängig von der Zellmorphologie entgegengesetzt exprimiert. Durch den Austausch der gesamten MOM1-Promotorregion durch den EFG1-Promotor konnte jedoch Art und Verlauf der C. albicans EFG1-Induktion auch in C. dubliniensis beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die antagonistische Genexpression hauptsächlich auf verschiedene cis-regulatorische Elemente in den jeweiligen Promotorsequenzen von MOM1 und EFG1 zurückgeführt werden können. Interessanterweise konnten wir trotz der gleichen C. albicans-spezifischen Regulation des heterolog exprimierten EFG1 mit Promotor im ∆mom1-Deletionshintergrund keine Induktion des hyphalen Wachstums in C. dubliniensis beobachtet werden. Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass die morphologische Transition in C. albicans durch einen weiteren regulatorscher Signalweg induziert wid, der in C. dubliniensis entweder nicht vorhanden oder aktiviert ist. Diese Aktivierung von verschiedenen Signaltransduktionswegen oder die differentielle Regulation von Genen können somit die Gründe dafür sein, weshalb so phylogenetisch nahe verwandte Arten sich in der Expression von Virulenzfaktoren und ihrer Pathogenität unterscheiden.
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Lokalisation von Tsa1p, einem thiolspezifischen Antioxidant-ähnlichen Protein aus Candida albicans und dessen Einfluss auf die Wirt-Pathogen-Interaktion
(2011) Brachhold, Martina; Rupp, Steffen (PD Dr.)
Der Hefepilz Candida albicans lebt als opportunistischer, kommensalischer Organismus hauptsächlich auf Haut und Schleimhäuten des Verdauungs- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Allerdings kann C. albicans bei immunkomprimierten Menschen auch lebensbedrohliche Infektionen auslösen. Die Zellwand von C. albicans und deren Zusammensetzung spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung oder Abwehr einer Infektion. Zellwandbestandteile vermitteln die Adhäsion und Invasion in Wirtsgewebe und tragen somit entscheidend zur Pathogenität des Organismus bei. Bestandteile der Zellwand dienen dem Immunsystem des Wirtes jedoch als antigene Strukturen, die von Immunzellen erkannt werden können; dies kann schließlich zur Abtötung des Pathogens führen. Das thiolspezifische Antioxidant-ähnliche Protein Tsa1p ist ein differentiell lokalisiertes Protein, das sowohl an der Zellwand sowie im Cytosol und Nukleus der Zellen gefunden wird. Im Cytosol übernimmt das Protein unter anderem die Funktion, Zellen vor oxidativem Stress zu schützen. Trotz der Zellwandlokalisation besitzt das Protein keine N-terminale Signalsequenz, die es ihm ermöglichen würde, in den klassischen ER/Golgi-vermittelten Sekretionsweg einzutreten. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Identifizierung der molekularen Determinanten und relevanten Signaltransduktionswege, die für den Transport des Proteins an die Zelloberfläche verantwortlich sind. Es konnte gezeigt werden, dass Tsa1p durch einen nicht-klassischen, vom ER/Golgi-unabhängigen Transportweg an die Zelloberfläche gelangt. Es wurden verschiedene Bedingungen identifiziert, die zu einer Lokalisation des Proteins an die Zelloberfläche führen: die Wachstumsphase der Zellen sowie Stressinduktion spielen hierbei unter anderem eine Rolle. Durch Erzeugen verschiedener Punktmutationen in Tsa1p konnten wichtige Determinanten der Translokation des Proteins an die Zelloberfläche identifiziert werden. Beide katalytisch aktiven Cysteine des Proteins werden für die Lokalisation an die Zelloberfläche benötigt, nicht aber dessen C-Terminus. Diese Mutanten zeigten ebenfalls eine Veränderung in der Zusammensetzung ihrer Zellwand bezüglich der Zugänglichkeit des Bestandteils β-1,3-Glucan. Auch die Erkennung durch Immunzellen war bei diesen Stämmen gegenüber dem Wildtyp verändert. Es konnte somit gezeigt werden, dass Tsa1p eine wichtige Funktion an der Zellwand besitzt, welche mit der Wirt-Pathogen-Interaktion zusammenhängt.
Open Access
Phänotypische und molekularbiologische Untersuchungen der Interaktionen in gemischten Biofilmen
(2012) Purschke, Frauke Gina; Rupp, Steffen (PD Dr.)
Die Mehrheit der Mikroorganismen lebt in ihrer natürlichen Umgebung in Biofilmen, oberflächenassoziierten Lebensgemeinschaften, die normalerweise von einer extra-zellulären Matrix umgeben sind. Die meisten Biofilme werden nicht von einzelnen sondern mehreren Spezies gebildet, die in den Biofilmen nicht nur miteinander kooperieren, sondern auch um vorhandene Nährstoffe konkurrieren. Die Gram-negative Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa und der polymorphe Pilz Candida albicans sind zwei opportunistisch Pathogene, die oft in Co-Existenz in einem humanen Wirt nachgewiesen werden. Verschiedene Modelle antagonistischen Verhaltens wurden für diese Organismen in gemischten Biofilmen berichtet. Um diese Inter-aktionen zwischen P. aeruginosa und C. albicans genauer zu erforschen, wurde der Einfluss der Quorum sensing Moleküle untersucht. Hierfür wurde ein in vitro Assay etabliert, der eine einfache und schnelle Detektion von Veränderungen in der Aus-prägung von Biofilmen erlaubt. Während sowohl Überstände als auch nur das für die Biofilmbildung von P. aeruginosa wichtige Quorum sensing Molekül N-3-oxo-dodecanoyl-homoserinlacton die Biofilmbildung von C. albicans unterdrücken, wirkt Farnesol, der Pilz-Autoinducer, zwar inhibierend auf die Adhärenz, aber verstärkend auf bereits bestehende bakterielle Biofilme. Zur weiteren Charakteriserung dieser Interaktion wurde das Sekretom einzelner und gemischter Biofilme zu verschiedenen Zeitpunkten mit MALDI-TOF MS/MS analysiert. Insgesamt wurden 247 unter-schiedliche Proteine identifiziert, von denen 170 P. aeruginosa und 77 C. albicans zugeordnet werden konnten. P. aeruginosa sekretierte in Anwesenheit von C. albicans Virulenzfaktoren wie das Exotoxin A sowie Proteine der Stoffwechselwege zur Eisenerfassung wie das Pyochelin-Biosynthese-Protein PchD und den Ferripyoverdin-Rezeptor FpvA. Außerdem wurde in gemischten Biofilmen jedoch nicht in rein bakteriellen Biofilmen das Siderophor Pyoverdin identifiziert, das Eisen mit großer Affinität bindet. Dieses deutet darauf hin, dass P. aeruginosa in Konkurrenz mit C. albicans die Wege zur Eisenaufnahme induziert. Von C. albicans dagegen wird der Metabolismus reprimiert, inklusive der detektierten eisenbindenden Proteine. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mikroorganismen nicht nur mit dem Wirt um essentielle Nährstoffe konkurrieren, sondern auch mit der vorhandenen Mikroflora. Die transkriptionellen Veränderungen während der Ausbildung von Biofilmen wurden genutzt, um Reporterstämme in C. albicans, P. aeruginosa und dem nicht-pathogenen E. coli herzustellen, welche die Bildung von Biofilmen anzeigen. Mit Hilfe dieser Stämme können Quorum sensing Moleküle anderer Mikroorganismen detektiert werden. Gemeinsam mit dem in vitro Assay steht mit diesen Stämmen eine Toolbox zur Verfügung, um Biofilme und Einflüsse auf diese zu charakterisieren.