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    Array-basierte Identifizierung humanpathogener Schimmel- und Hefepilze für die klinische Diagnostik
    (2015) Mayer, Linda S. L.; Rupp, Steffen (apl. Prof. Dr.)
    Die Zahl der invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten nahm in den letzten Jahren stetig zu. Betroffen sind u.a. Frühgeborene, Krebs- und AIDS-Patienten, Transplantierte sowie Mukoviszidose-Patienten. Zeitintensive Diagnostikmethoden in den klinischen Laboratorien können bei invasiven fungalen Infektionen zu hohen Mortalitätsraten der betroffenen Patienten führen. Diese Methoden beruhen auf Kultivierungen der Patientenproben sowie morphologischen und physiologischen Tests. Empirische Therapien ohne klare Diagnose bergen neben Unwirksamkeiten und Resistenzentwicklungen auch die Gefahr massiver Nebenwirkungen, die den Zustand der Patienten verschlechtern können. Bei fungalen Infektionen kann die Kultivierungszeit der Patientenproben bis zu einem eindeutig positiven oder negativen Ergebnis, Tage und sogar Wochen in Anspruch nehmen. Durch eine zeitnahe und adäquate Medikation infolge einer schnellen und speziesspezifischen Identifizierung direkt aus der Patientenprobe könnte die Lebenserwartung der Patienten erhöht werden. Dies bedarf einer sensitiven Identifizierungsmethode, die selbst sehr geringe Zellzahlen auf Spezieseben nachzuweisen vermag. In dieser Arbeit wurde ein PCR-Array-System basierend auf konservierten und variablen Sequenzen der Internal transcribed spacer Region des ribosomalen Clusters für den Nachweis humanpathogener Pilze etabliert. Durch den Einsatz panfungaler Primer in der etablierten ITS-Nested-PCR konnte eine Mindestmenge von zehn fungalen DNA-Molekülen bei hohem humanem DNA-Hintergrund zuverlässig amplifiziert werden. Von insgesamt 566 entwickelten DNA-Oligonukleotid-Sonden wurden 96 ITS-Sonden ausgewählt. Diese erlaubten eine simultane Überprüfung der amplifizierten ITS-Region auf 56 humanpathogene fungale Spezies. Das etablierte finale PCR-Array-System wurde mit fungaler Referenz-DNA bei humanem DNA-Hintergrund evaluiert. Bei 64 % der hybridisierten Spezies waren ausschließlich Signale auf den zugehörigen 30 Antisense-Sonden für diese Spezies zu verzeichnen. 36% der hybridisierten Spezies führten neben speziesspezifischen Signalen zudem zu Signalen auf Sonden, die nicht der hybridisierten Spezies zuzuordnen waren. Allerdings wiesen die unspezifischen Sondensignale hauptsächlich Intensitäten nahe des Detektionsschwellenwertes auf. Die statistische Bewertung des PCR-Array-Systems wies eine Richtig-Positiv-Rate von 100 % und eine Richtig-Negativ-Rate von 99 % für Einzelspezies-Hybridisierungen auf. Durch eine Zwei-Sonden-Diskriminierung, die bei monomikrobiellen Infektionen herangezogen werden könnte, ist bei diesen Spezies jedoch eine eindeutige Diskriminierung möglich. Die Evaluierung des Systems mit DNA aus Trachealsekreten und Bronchoalveolären Lavages zeigte, dass diese Unspezifitäten Spezies betraf, die für das untersuchte Probenmaterial klinisch weniger relevant waren wie bspw. Dermatophyten. Klinisch für die untersuchten Probenmaterialen relevantere Spezies wie Candida albicans und Nicht-albicans Candida Spezies konnten anhand spezifischer Sonden eindeutig identifiziert werden, wobei im Fall von Nicht-albicans Candida Spezies eine spezifischere Klassifizierung möglich war, als durch in der klinischen Diagnostik aktuell angewandte mikrobiologische Methoden. Bei 102 Patientenproben - Trachealsekreten und Bronchoalveolären Lavages - stimmte das Ergebnis des PCR-Array-Systems mit den mikrobiologische Befunden überein. Für 23 Proben konnte der mikrobiologische Befund durch die Ergebnisse des Systems erweitert werden. Bei weiteren 23 Proben wurden, mittels des entwickelten PCR-Array-Systems, weniger Spezies als durch mikrobiologische Methoden identifiziert. Lediglich bei drei Proben wurden komplett abweichende Array-Befunde erzielt.Beginnend mit der DNA-Isolierung der Patientenproben ist durch das in dieser Arbeit etablierte PCR-Array-System eine speziesspezifische Identifizierung und adäquate Medikation der Patienten innerhalb weniger Stunden realisierbar und würde zu einer erhöhten Überlebenschance dieser beitragen.
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    Etablierung und Evaluierung molekularbiologischer Verfahren zur Analyse zellfreier DNA für die Infektions- und Tumordiagnostik
    (2024) Hartwig, Christina; Rupp, Steffen (apl. Prof. Dr.)
    Zellfreie DNA (cfDNA) ist ein Biomolekül, das extrazellulär in verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Blut(-plasma) oder Urin gefunden werden kann. Sie ist Träger von Erbinformation und besitzt eine relativ kurze Halbwertszeit. Diese kurze Halbwertszeit ist nützlich, um die aktuelle cfDNA-Konzentration und damit den physiologischen Zustand spezifisch bestimmen zu können. Somit kann cfDNA als Biomarker für diagnostische Zwecke eingesetzt werden. Neben ihren biologisch vorteilhaften Eigenschaften kann sie außerdem über eine Blutentnahme minimal-invasiv in Form einer sogenannten Flüssigbiopsie entnommen werden und somit eine risikobehaftete Gewebebiopsie vermieden werden. Mithilfe von Next-Generation Sequencing (NGS) sollte cfDNA im Rahmen dieser kumulativ verfassten Doktorarbeit analysiert und in verschiedenen Anwendungsgebieten auf ihre Eignung als Biomarker untersucht werden. Die zugrundeliegenden Publikationen sind in Kapitel 7.2 beigelegt. Im ersten Teil dieser Dissertation wurden die Charakteristika von mikrobieller cfDNA (mcfDNA) in der Infektionsdiagnostik am Beispiel der Sepsis untersucht. In einem Mausmodell wurde unter definierten Bedingungen die zeitliche und räumliche Dynamik von mcfDNA während einer Sepsis nachverfolgt und daraus ein Workflow für die individuelle Charakterisierung des pathologischen Mikrobioms – im Folgenden Pathobiom – und seiner dynamischen Veränderungen entwickelt. Zunächst wurde das Darmmikrobiom von gesunden Mäusen als Reservoir für Sepsis-verursachende Erreger bestimmt. Das physiologische Darmmikrobiom veränderte sich rapide nach Induktion einer Sepsis: Schon nach 24 h bildete sich ein Pathobiom im Darm, das sehr individuell ausgeprägt war. Im nächsten Schritt wurde die räumliche Transition des Pathobioms aus dem Darm in andere Kompartimente wie das normalerweise sterile Peritoneum und den Blutkreislauf untersucht. Auch hier konnten starke Veränderungen bereits nach 24 h in Peritoneum und Blut detektiert und mit unterschiedlichen Methoden nachgewiesen werden: Die Befunde von klassischer Blutkultur und NGS deckten sich weitestgehend, wobei mit NGS zusätzlich deutlich mehr Spezies identifiziert werden konnten. Die Pathobiome unterschieden sich teilweise zwischen einzelnen Mäusen deutlich, es konnten aber im Vergleich zu humanen Proben deutliche Überlappungen mikrobieller Genera identifiziert werden, welche als hauptsächliche Erreger bei einer Sepsis auftreten. Schließlich wurde eine Formel entwickelt, mit deren Hilfe die absolute Erregerbelastung im Blut berechnet werden konnte. Für die Analyse reichten kleinste Blutmengen von nur 30 µl, was die serielle Probenentnahme in Mäusen erst ermöglichte. Folglich konnten einzelne Mäuse über einen Zeitraum von 72 h analysiert werden. Nach 24 h wurde die höchste mikrobielle Belastung festgestellt, es konnten aber auch dynamische Veränderungen innerhalb weniger Stunden festgestellt werden. So ließ sich in dieser Studie eine kurze Halbwertszeit für mcfDNA ableiten und diese DNA-Klasse damit als sensitiver und adäquater Marker für die Sepsisdiagnostik etabliert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit widmete sich der Charakterisierung epigenetischer Marker von humaner cfDNA für die Diagnostik von pankreatobiliären Krebsformen (PBC), wobei hier im Speziellen DNA-Methylierungsmuster (als Information innerhalb der cfDNA) als Biomarker im Fokus standen. Ziel war es, Regionen im Genom zu identifizieren, die zwischen PBC-Patienten und Kontrollgruppen in unterschiedlichem Maße methyliert waren. Aus diesen differenziell methylierten Regionen (DMRs) sollten ein Target-Panel gebildet werden, das basierend auf NGS von Patienten-cfDNA im hohen Durchsatz sensitive und spezifische Diagnostik ermöglichen sollte. Im ersten Schritt wurde methylierte cfDNA unspezifisch angereichert und mithilfe von NGS sequenziert. Die erhobenen Daten wurden mit drei unterschiedlichen bioinformatischen Methoden ausgewertet und DMRs damit bestimmt. Diese wurden zusammen mit bereits publizierten Regionen aus der Literatur sowie neu bestimmten Regionen aus Gebewebedatenbanken zu einem Sequenzierpanel zusammengefügt, welches für die zielgerichtete Methode Hybridization and Capture verwendet wurde. Zusätzliche klinisch erhobene Daten wie der in der Routine bereits etablierte Tumor-Proteinmarker CA19-9 wurden nur als ergänzende Information für das Panel herangezogen, da diese im Gegensatz zu den Sequenzierdaten in dieser Kohorte bisher keine zuverlässige Unterscheidung zwischen Patientengruppen erlaubten. Das Hybridization and Capture-Panel wurde schließlich für die Sequenzierung von je 15 PBC-, 15 Pankreatitis- sowie 15 Kontroll-Patienten verwendet. In Kombination mit den CA19-9-Werten der Patienten wurde ein Machine-Learning-Ansatz angewendet, um in der Identifizierungskohorte die 50 besten Markerpositionen zu identifizieren. Mit diesen konnte eine Sensitivität von 93%, eine Spezifität von 63% und eine Fläche unter der ROC-Kurve von 0,85 erreicht werden. Anschließend wurde eine Validierungskohorte bestehend aus je zehn Patienten aus der PBC-, Pankreatitis- und Kontrollgruppe sowie sieben IPMN-Patienten sequenziert. In dieser Kohorte wurde eine Sensitivität von 92%, eine Spezifität von 84% und eine Fläche unter der ROC-Kurve von 0,88 erzielt. Außerdem konnten die High-grade-IPMNs und PBC-Patienten gut von Low-grade-IPMNs, Pankreatitis und Kontrollen unterschieden werden. Somit konnten Patienten identifiziert werden, welche eine intensivere Behandlung bzw. eine Operation benötigten. Methylierte cfDNA birgt folglich großes diagnostisches Potenzial für Pankreaserkrankungen und zeigte in dieser Publikation sensitive Eigenschaften, die für eine große Anzahl an (Krebs-)Erkrankungen genutzt werden könnten. Im dritten und abschließenden Teil im Rahmen dieser Doktorarbeit war das Ziel, eine spezifische Klasse an kurzen cfDNA-Fragmenten aus Gesamt-cfDNA zu charakterisieren. Die Hypothese war, dass kurze cfDNA-Fragmente (20-60 bp) regulatorische Informationen im systemischen Kontext eines Individuums enthalten, welche in der Diagnostik als differenzielle Marker genutzt werden können. Hierfür wurde zunächst ein Verfahren zur Größenselektion von cfDNA etabliert, welches mithilfe von Gelelektrophorese die Anreicherung intakter doppelsträngiger kurzer DNA-Fragmente ermöglichte. Kurze cfDNA reicherte sich in spezifischen genomischen Positionen an, und zeigte schmale, definierte als auch breite Cluster-Peaks. Dabei zeichneten sich Cluster-Peaks meist durch die Nähe zu Transkriptionsstartpunkten (TSPs) oder Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBS) aus. Ein Vergleich zu regulärer cfDNA offenbarte, dass sie sich gegensätzlich verhielt: Die Anreicherung der einen cfDNA-Klasse bedeutete die Abreicherung der anderen zum Beispiel an offenem Chromatin, Nukleosom-freien Regionen oder TSPs. Kurze cfDNA schien somit kein Abbauprodukt der regulären cfDNA zu sein, sondern eher durch die Bindung von Transkriptionsfaktoren (nicht Nukleosomen wie bei regulärer cfDNA) vor dem Abbau von DNasen geschützt zu sein. Mithilfe der kurzen cfDNA konnte auch über Transkriptionsfaktormotiv-Anreicherung oder die Analyse bekannter Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBS) eine potenzielle Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren (TFs) detektiert werden. Dies deutete bereits auf den Bezug von kurzer cfDNA zu transkriptionellen Vorgängen hin. Darüber hinaus zeigte sich eine Abhängigkeit der Anreicherung von kurzer cfDNA in bestimmten Regionen von der epigenetischen und transkriptionellen Aktivität: Aktive Promotoren zeigten eine starke Anreicherung von kurzer cfDNA, wohingegen stark methylierte CpG-Inseln eine deutlich schwächere Anreicherung von kurzer cfDNA als wenig methylierte CpG-Inseln zeigten. Außerdem zeigten ergänzende RNA-Sequenzierungen die Anreicherung von kurzer cfDNA in Genen, die laut RNA-Analysen hoch exprimiert waren. Diese Beobachtungen erinnerten insgesamt an die Detektion von DNA-Footprints, bei denen die Bindung spezifischer DNA-Sequenzen an bestimmte Proteine durch den Schutz vor Abbau durch DNasen identifiziert wird. Folglich wurden die ableitbaren Transkriptionsfaktor-Footprints aus Flüssigbiopsien als Liquid Footprints bezeichnet. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die Sequenzierung von kurzer cfDNA die Detektion konditionsspezifischer TFBS in Flüssigbiopsien ermöglichte und die Unterscheidung vier klinischer Indikationen (PDAC, Kolorektalkrebs, Sepsis, Post-OP) möglich war. Dies unterstreicht die Möglichkeiten von Liquid Footprinting als explorative, unvoreingenommene Plattform zur Detektion diagnostischer Markerregionen für verschiedenste klinische Indikationen. Abschließend wurde ein kurzer Ausblick auf die Kombination von Methylierungsdaten und Transkriptionsfaktordaten gegeben. Es wurden beispielhaft zwei Regionen betrachtet, welche auf ein Zusammenspiel der beiden Datentypen und damit eine biologische Verknüpfung schließen lassen. Zukünftige Diagnostik könnte von der integrierten Analyse profitieren und das volle Potenzial der verschiedenen cfDNA-Klassen in Kombination ausschöpfen.
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    Optimization of cell-free protein synthesis by proteomics and metabolic engineering of Escherichia coli A19
    (2019) Foshag, Daniel; Rupp, Steffen (apl. Prof. Dr.)
    Cell-free protein synthesis (CFPS) has emerged as a standard protein production system over the last two decades. Due to its open nature and various methods of directly influencing protein expression, it has replaced or complemented in vivo expression systems, especially for the expression of toxins, membrane proteins and other difficult-to-express proteins. Despite the widespread use of CFPS, the main component of the system, an extract derived from the centrifugation of a bacterial lysate (S30 extract), still has not been defined thoroughly. S30 extract preparation often causes changes in protein composition, altering the original proteome of exponentially growing Escherichia coli (E. coli). To optimize CFPS in a rational manner, S30 extracts from the E. coli K12-derivative A19 were analyzed using a GeLC-MS approach. The S30 core proteome, consisting of 821 proteins detected in several replicates, was functionally integrated and categorized using GO terms, revealing the presence of complete pathways that can be explored for energy regeneration or precursor generation. To evaluate the effects of alternative growth conditions, S30 extracts derived from cells grown at SOS response-inducing conditions were analyzed by quantitative GeLC-MS using isotope-coded protein labeling (ICPL). These modified S30-S extracts contained 3-10-fold increased folding factors and were shown to improve the solubility and folding of difficult proteins. Therefore, the manipulation of the S30 extract proteome by modifying the cultivation conditions is an effective approach for the expression of challenging proteins. A second approach to improve CFPS productivity was the engineering of specific metabolic pathways through genetic modifications. Using the previously generated proteome as a guideline, 13 genes coding for various enzymes affecting protein, amino acid and mRNA stability were either tagged or knocked out in E. coli strains A19 and D10. After verifying the modifications by PCR and sequencing, the viability and fitness of the strains were examined. Additionally, the transcriptional profile of a heavily modified strain was compared with the original A19 strain, revealing highly coregulated transcriptome in response to the genetic modification. The amino acid concentrations of 19 amino acids were traced during a CFPS reaction, demonstrating that amino acids can be stabilized by genetic modifications. The engineered strains showed an increase in yield for some target proteins, highlighting the relevance of metabolic engineering when optimizing CFPS. Finally, one of the metabolically engineered strains was used as an extract source and combined with purified chaperones (DsbC, Skp and FkpA) to produce different antibody fragments. DsbC was the most important chaperone for Fab folding, whereas Skp and FkpA were beneficial to produce scFab.
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    The use of confocal Raman microscopy for the evaluation of in-vitro biofilm model structures
    (2022) Kriem, Lukas Simon; Rupp, Steffen (apl. Prof. Dr.)
    In nature, the majority of microorganisms grow and accumulate on surfaces. These microorganisms are in general surrounded by an extracellular matrix, also generating a biofilm. Extensive research has been done to further understand these biofilms, especially those that cause human diseases such as subgingival biofilms where their accumulation on teeth over time can cause gingivitis and periodontitis. While dynamics, formation and composition of these biofilms are well known, techniques for continuously monitoring the formation of subgingival biofilm are limited. In recent years, advancements in the field of optical spectroscopic techniques have provided an alternative for analyzing three-dimensional microbiological structures, in addition to the traditional destructive or biofilm staining techniques. In this work, it was demonstrated that the use of confocal Raman spectroscopy, coupled with multivariate analysis, provides an approach to differentiate common subgingival bacteria. In addition, a workflow was developed that allows for the spatial differentiation of bacteria in an in vitro model simulating a subgingival biofilm, a technique which was also confirmed by mapping a second mixed species in vitro biofilm found on medical devices. The present work demonstrates the use of confocal Raman Microscopy to differentiate common subgingival bacterial species (Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans, Veillonella dispar and Prevotella nigrescens) and including their identification in unknown samples. In a second step, a workflow was established to evaluate and differentiate bacterial species in two dual-species in vitro biofilm models, using confocal Raman microscopy. The first biofilm model comprised of Actinomyces denticolens and Streptococcus oralis was cultured using the ‘Zürich in vitro model’. Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa were cultured as a second dual-species biofilm to confirm the established workflow. Both biofilms were then analyzed using confocal Raman Microscopy. Cluster analysis was used to spatially differentiate and map the biofilm models over a specified area. To confirm species clustering within the cultured biofilms, confocal laser scanning microscopy was coupled with fluorescent in-vitro hybridization. Furthermore, dense bacteria interface area samples, as an artificial model of clusters in a biofilm, were used to test the developed multivariate differentiation model. This confirmed model was successfully used to differentiate species in a dual-species biofilm that were additionally compared and confirmed by morphology analysis. The results show that the developed workflow was able to identify main clusters of bacteria based on spectral ‘fingerprint region’ information acquired from confocal Raman microscopy. Using this workflow, it was demonstrated that confocal Raman microscopy can be used to spatially analyze dual-species in vitro biofilms, thus providing an alternative technique to map biofilm models.